納米硒提高雙孢菇子實(shí)體的硒含量和品質(zhì)

陳靜如，馮拓，單培，張盧軍，王博，張智宏，高獻(xiàn)禮*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）（2.江蘇佳谷生物科技有限公司，江蘇南京 211164）

1915年，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)硒（selenium，Se）能夠抑制腫瘤生長，1949年，動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)硒具有抗癌活性，人們逐漸意識到硒對健康的重要性。硒作為人體必需的微量非金屬元素，享有“生命的火種”、“心臟守護(hù)神”、“天然解毒劑”和“長壽元素”等美譽(yù)，常以輔酶因子或輔基形式存在于膜硒蛋白（包括脫碘酶類等）和游離硒蛋白（蛋氨酸硫氧化物還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧環(huán)蛋白還原酶類）等[1,2]。硒缺乏會影響硒蛋白合成并導(dǎo)致硒酶活力降低，導(dǎo)致免疫力降低、新陳代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)各類疾病如甲狀腺疾病、糖尿病、人類生殖障礙和肥胖癥等[3,4]。因此，硒是人體所不可或缺的一種微量營養(yǎng)素。

日常飲食是獲取硒的最佳途徑[5]。我國居民膳食結(jié)構(gòu)以蔬菜和谷物為主，其硒含量依賴于種植土壤中硒含量。然而，我國72%以上國土面積為低硒地區(qū)，特別是黑龍江和東部沿海地區(qū)，土地上生產(chǎn)的大部分蔬菜和谷物中硒量低于0.01 mg/kg，而且超過1/3以上的居民硒攝入量不足國家最低推薦量的一半（50 μg/d）[6,7]。因此，大力開發(fā)富硒農(nóng)產(chǎn)品、改善國民缺硒狀況，具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

雙孢菇（Agaricus bisporus）屬蘑菇科蘑菇屬，色白質(zhì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，藥食兩用[8,9]。雙孢菇廣泛栽培于北美、歐洲和亞洲的溫帶地區(qū)，隨著栽培技術(shù)的推廣和發(fā)展，雙孢菇的工廠化大規(guī)模生產(chǎn)，被稱為“世界菇”，深受消費(fèi)者青睞[8,9]。研究表明，雙孢菇富硒能力很強(qiáng)，能將大部分無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為易吸收代謝的有機(jī)硒[9,10]。Prange等[10]研究了經(jīng)10 mg/kg亞硒酸鹽處理后的雙孢菇中硒的形態(tài)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙孢菇中有機(jī)硒含量占總硒的90%，由此可見雙孢菇優(yōu)良的硒有機(jī)轉(zhuǎn)化能力。

雙孢菇的富硒栽培，目前多數(shù)研究集中于無機(jī)硒（包括硒酸鹽、亞硒酸鹽等）的應(yīng)用，如果使用不當(dāng)，將對生物和環(huán)境造成危害。納米硒具有低毒安全、高吸收率和高生物活性等特性[11]，其體內(nèi)、體外抗氧化活性[11]、抑菌[12]、抗真菌活性[13]和提高免疫能力[14]已經(jīng)被證明。然而，納米硒在雙孢菇的富硒栽培中的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。

殼聚糖，甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，是自然界中天然堿性多糖，具備優(yōu)良生物可降解性、生物相容性和無毒等特性，來源和應(yīng)用非常廣泛[11,15]。

蔣斌[15]研究了在鎘污染條件下，在生菜和水稻葉面噴施納米硒-殼聚糖復(fù)合肥對生菜和水稻生長和品質(zhì)的影響，結(jié)果表明納米硒-殼聚糖復(fù)合肥能夠有效降低生菜中鎘的含量，并能顯著提高生菜的營養(yǎng)品質(zhì)，同時(shí)納米硒-殼聚糖復(fù)合肥不僅能夠降低水稻對鎘的吸收率，同時(shí)也能使水稻富硒，提高大米的品質(zhì)，由此可見納米硒和殼聚糖復(fù)合物具有良好且正向的生物協(xié)同效應(yīng)。

因此，本研究使用殼聚糖軟模板法制備了性質(zhì)穩(wěn)定的納米硒，并以栽培范圍廣泛、富硒能力及硒有機(jī)轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)和營養(yǎng)豐富的雙孢菇為研究對象，采用將納米硒溶液添加到培養(yǎng)基中的方法，進(jìn)行雙孢菇的富硒栽培，通過分析不同濃度納米硒處理對雙孢菇子實(shí)體基本成分含量和單朵均重的影響，并借助聚類分析和主成分分析法來確定納米硒的最佳使用量，以期為富硒雙孢菇的深入研究以及工廠化的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

雙孢菇菌種為As2796，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供?？箟难帷⑽鴺?biāo)準(zhǔn)溶液、18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。三氯乙酸、苯酚、氫氧化鈉、亞硒酸鈉、石油醚、氫氧化鉀、葡萄糖等其他化學(xué)藥品為分析純，購自國藥集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S-3700N型高新掃描電子顯微鏡，日立科學(xué)儀器（北京）有限公司；HORIBA EMAX型X射線能譜儀，天美儀拓實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（上海）有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SH220F型石墨消解儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；DFY1000型搖擺式粉碎機(jī)，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；EX223型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；K1100F型全自動凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；MD SpectraMax M2型多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices，USA。

1.3 納米硒的制備與表征

活性納米硒制備參照高獻(xiàn)禮等[16]的方法，具體步驟如下：取25 mL 0.1 mol/L的Na2SeO3和30 mL 10 g/L的殼聚糖溶液置于250 mL的具塞棕色錐形瓶中，于恒溫?fù)u床中振搖0.5 h后，再加入25 mL 0.5 mol/L的抗壞血酸溶液，并加蒸餾水至總體積為100 mL，混合均勻后，置于恒溫?fù)u床中振搖1 h，獲得0.025 mol/L（以Se計(jì)）紅色納米硒溶液。

利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和X射線能譜分析儀對制備的納米硒進(jìn)行形貌觀察及成分分析。

1.4 雙孢菇培養(yǎng)基設(shè)計(jì)及配置

雙孢菇培養(yǎng)基的配方參照陳全勝等[17]確定的最佳配方，培養(yǎng)基的發(fā)酵及雙孢菇的培養(yǎng)參照陳全勝等[17]的方法，其中在培養(yǎng)基翻堆補(bǔ)水時(shí)，分別向培養(yǎng)基中加入不同量的納米硒，使納米硒的濃度分別為0.5 mg/kg干基（Treatment 1，T1）、1.0 mg/kg干基（Treatment 2，T2）、1.5 mg/kg干基（Treatment 3，T3）、2.0 mg/kg干基（Treatment 4，T4）、2.5 mg/kg干基（Treatment 5，T5），對照組（Control Check，CK）中不添加納米硒。

1.5 基本成分的測定

1.5.1 水分含量的測定

將待測鮮雙孢菇子實(shí)體樣品切片，稱取約100.0 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后四位）樣品置于電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，在108 ℃下干燥至恒重后，稱量樣品干樣并計(jì)算結(jié)果。將干樣粉碎后過60目篩，得到的雙孢菇干粉樣品置于干燥皿中保存，便于后續(xù)指標(biāo)的測定。

1.5.2 粗多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定雙孢菇子實(shí)體中粗多糖含量，具體參照NY/T 1676-2008，該結(jié)果以g/100 g dry weight（g/100 g DW）表示。

1.5.3 總氮含量的測定

準(zhǔn)確稱取約1.0 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后四位）雙孢菇干粉樣品與1～2片定氮消化片放入消化管中，加入10～15 mL濃硫酸溶液，先設(shè)置消解儀溫度220 ℃消化40 min后，再設(shè)置消解儀溫度420 ℃消化約2 h至溶液變澄清，待消化管冷卻后使用全自動凱氏定氮儀蒸餾檢測。

1.5.4 粗脂肪含量的測定

參照王宇等[18]的方法略作修改用以測定雙孢菇子實(shí)體中粗脂肪含量，該結(jié)果以g/100 g DW表示。

1.5.5 粗纖維含量的測定

雙孢菇子實(shí)體中粗纖維含量的測定參照GB/T 5009.10-2003，該結(jié)果以g/100 g DW表示。

1.5.6 硒含量的測定

參照GB 5009.93-2017中的第三法，電感耦合等離子體質(zhì)譜法來測定雙孢菇子實(shí)體中硒含量，該結(jié)果以mg/kg DW表示。

1.5.7 游離氨基酸的測定

根據(jù)Gao等[19]的方法稍加修改來測定游離氨基酸。用天平稱取1.0 g左右（精確到小數(shù)點(diǎn)后四位）的雙孢菇干粉樣品，用5 g/100 mL三氯乙酸定容至25 mL，混勻后常溫超聲20 min，靜置2 h后用雙層濾紙過濾，取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管內(nèi)，置于離心機(jī)中以15000 r/min離心30 min，再將上清液用0.45 μm孔徑的微孔過濾器過濾，通過柱前衍生化后上機(jī)分析。采用PICO·TAG氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm），測定波長為254 nm，溫度為38 ℃，洗脫液流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品來定量。

1.5.8 總氨基酸的測定

在孫鵬飛等[20]的方法基礎(chǔ)上稍加修改，具體方法如下：稱取0.2 g左右的雙孢菇干粉樣品，先加入4 mL 6 mol/L HCl搖勻潤濕，再加入4 mL 6 mol/L HCl，搖勻充氮?dú)猓ㄕ{(diào)節(jié)N2流速，使溶液呈微沸狀態(tài)）3 min后擰緊水解管蓋，放入已設(shè)定為120 ℃的烘箱中，水解22 h。水解結(jié)束后，待溶液冷卻，將水解管樣品全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加4.8 mL 10 mol/L NaOH中和，用蒸餾水定容至25 mL，雙層濾紙過濾后，取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管內(nèi)，置于離心機(jī)中以15000 r/min離心30 min，再將上清液用0.45 μm孔徑的微孔過濾器過濾，通過柱前衍生化后上機(jī)分析。其他步驟參照游離氨基酸的測定方法。測定結(jié)果為除色氨酸外的常見17種氨基酸含量。

稱取0.2 g左右的雙孢菇干粉樣品，先加入4 mL 5 mol/L NaOH搖勻潤濕，再加入4 mL 5 mol/L NaOH，搖勻充氮?dú)猓ㄕ{(diào)節(jié)N2流速，使溶液呈微沸狀態(tài)）3 min后擰緊水解管蓋，放入已設(shè)定為120 ℃的烘箱中，水解22 h。水解結(jié)束后，待溶液冷卻，將水解管樣品全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加6.7 mL 6 mol/L HCl中和，用蒸餾水定容至25 mL，雙層濾紙過濾后，取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管內(nèi)，置于離心機(jī)中以15000 r/min離心30 min，再將上清液用0.45 μm孔徑的微孔過濾器過濾，通過柱前衍生化后上機(jī)分析。其他步驟參照游離氨基酸的測定方法。測定結(jié)果為色氨酸含量。

1.5.9 單朵均重的測定

將采集的雙孢菇子實(shí)體按尺寸大小分類好，各處理選擇尺寸基本相當(dāng)且量最多的雙孢菇子實(shí)體100個(gè)，測定總重，取平均值為單朵均重。

1.5.10 保藏期的測定

將采集的雙孢菇子實(shí)體包裝好后，置于冷庫中0～4 ℃低溫冷藏。每日定時(shí)去冷庫觀察雙孢菇子實(shí)體樣品的褐變、開傘、腐爛和失水情況，及時(shí)記錄并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測定3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示各測定數(shù)據(jù)。運(yùn)用SPSS 18.0軟件（SPSS公司，美國）進(jìn)行單因素方差分析（在檢驗(yàn)水平為0.05的條件下進(jìn)行顯著性差異分析）、聚類分析（采用的聚類方法為組間聯(lián)接；度量標(biāo)準(zhǔn)下區(qū)間采用的平方Euclidean距離）以及主成分分析（采用因子分析）。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米硒的微觀形貌及粒徑大小

圖1a和圖1b展示了納米硒的掃描電子顯微鏡圖像。如圖1a所示，本研究制備的納米硒顆粒在納米硒-殼聚糖體系中呈現(xiàn)出相對均勻的分散狀態(tài)。將圖1a放大10倍的SEM圖像如圖1b所示，可以看出該納米硒的形貌完整，呈現(xiàn)為規(guī)則的球形狀態(tài)，而硒納米球體系通常應(yīng)用于膳食補(bǔ)充領(lǐng)域[11]，因此本研究制備的納米硒可應(yīng)用于富硒雙孢菇的開發(fā)中。此外，如圖1c所示，絕大部分球形納米硒的直徑范圍為37.5～75 nm，平均直徑在52 nm左右，同樣地，Bai等[21]以殼聚糖為軟模板，合成了平均直徑約50 nm、高度均勻的納米硒；翟曉娜[11]以分子量小于等于3 ku的殼聚糖，脫乙酰度大于85%的殼聚糖為穩(wěn)定劑，成功制備出分散狀態(tài)良好、粒徑約為50 nm左右的球形納米硒顆粒，很明顯，本研究所制備出的納米硒平均粒徑與Bai等[21]和翟曉娜[11]的基本相當(dāng)。

2.2 納米硒的元素組成

如圖2a所示，實(shí)驗(yàn)制備的納米硒含C、O、Na、Se四種主要元素：C、O元素來自軟模板殼聚糖［(C6H11NO4)n］和被還原的Na2SeO3，Na、Se元素來自被還原的Na2SeO3。N元素與C、O元素相鄰，納米硒中含N量很低，不易被能量分析光譜儀所識別，導(dǎo)致本次實(shí)驗(yàn)N元素未被檢出。

納米硒的元素分布如圖2b所示，納米硒主要由57%左右的C元素、21%左右的Se元素、16%左右的O元素和6%左右的Na元素所組成，C元素含量如此之高的原因在于本研究所制備的納米硒可能為“單核-單殼”結(jié)構(gòu)，即單個(gè)納米硒被一層較厚的殼聚糖所包埋，而殼聚糖的基本組成單位為氨基葡萄糖，有6個(gè)C原子，這可以很好的解釋C元素顯著含量高于Se元素的原因[11]。

2.3 基本成分的比較

2.3.1 水分

水分分析結(jié)果如表1所示，不同處理組的水分含量范圍為90.15%（CK，對照）～91.58%（T5，2.5 mg/kg），且各樣品間均無顯著差異（p＞0.05）。Pei等[22]將雙孢菇鮮樣切片后，于105 ℃下干燥7～8 h后，測得其含水量為92.19%左右，與本研究所測雙孢菇水分含量基本相當(dāng)。潘亞璐[23]研究了不同濃度的亞硒酸鈉對雙孢菇菌絲體干重的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)硒濃度≤20 mg/L時(shí)，雙孢菇菌絲體干重?zé)o顯著差異，當(dāng)硒濃度≥40 mg/L時(shí)，雙孢菇菌絲體的生長受到了很明顯的抑制，說明在高濃度硒的作用下，雙孢菇的生長會受到抑制，阻礙雙孢菇中有機(jī)物質(zhì)的合成，并且由于其生長環(huán)境比較潮濕，水分可能更容易在生長受到抑制的雙孢菇內(nèi)積累，從而導(dǎo)致雙孢菇水分含量的上升。因此，盡管本研究的納米硒處理濃度較低，對雙孢菇的水分含量無顯著影響，但雙孢菇的水分含量還是會隨著納米硒處理濃度的增大而緩慢上升，在納米硒處理濃度為2.5 mg/kg有較為明顯的上升，說明納米硒處理濃度的高低會對雙孢菇的生長和代謝產(chǎn)生一定積極或消極的影響。

2.3.2 粗多糖

粗多糖分析結(jié)果如表1所示，不同處理組的粗多糖含量范圍為2.94 g/100 g FW（T5，2.5 mg/kg）～3.76 g/100 g FW（T2，1.0 mg/kg），除T2（1.0 mg/kg）與T3（1.5 mg/kg）、T4（2.0 mg/kg），T1（0.5 mg/kg）與CK（對照）間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。吳圣進(jìn)等[24]研究了覆土添加亞硒酸鈉對雙孢菇中粗多糖的影響，結(jié)果表明雙孢菇中粗多糖范圍為3.37%～3.75%，與本研究的基本相當(dāng)。從表1可以看出雙孢菇中粗多糖的含量隨著納米硒處理濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)納米硒處理濃度達(dá)到2.5 mg/kg時(shí)，雙孢菇中粗多糖含量已經(jīng)顯著低于對照，可能原因在于過高的納米硒處理濃度會誘導(dǎo)雙孢菇進(jìn)行脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)生的大量活性氧自由基會嚴(yán)重阻礙糖類物質(zhì)的合成[9]。

2.3.3 總氮

總氮分析結(jié)果如表1所示，不同處理組的總氮含量范圍為5.63%（T5，2.5 mg/kg）～6.39%（T2，1.0 mg/kg），除T2（1.0 mg/kg），T1（0.5 mg/kg）與T3（1.5 mg/kg）、T1（0.5 mg/kg），T3（1.5 mg/kg），CK（對照）與T4（2.0 mg/kg）、CK（對照），T4（2.0 mg/kg）與T5（2.5 mg/kg）間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。吳圣進(jìn)等[24]研究結(jié)果表明不同處理的雙孢菇子實(shí)體中粗蛋白含量范圍為44.2%～46.5%，根據(jù)1 g氮≈6.25 g蛋白質(zhì)，將本研究所測出的總氮量進(jìn)行換算，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量范圍為35.19%～39.94%，低于吳圣進(jìn)等[24]研究結(jié)果，可能是因?yàn)閮身?xiàng)研究的測定方法不同而導(dǎo)致的結(jié)果差異。

此外，從表1可以看出雙孢菇中總氮的含量隨著納米硒處理濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可以看出納米硒能夠影響雙孢菇中含氮物質(zhì)的合成與積累。

硒在生物體內(nèi)主要通過硒蛋白來發(fā)揮生理活性作用[2]，而硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸等形式存在于硒蛋白中[25]，并且硒蛋白的合成離不開硒的參與，譬如分泌蛋白，又稱硒蛋白P，其存在10個(gè)硒代半胱氨酸殘基，是血液硒的主要貢獻(xiàn)者[1]，它的正常合成需要攝入高于機(jī)體合成正常水平的谷胱甘肽過氧化物酶所需的硒[26]，可以推斷多攝入的硒會增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶的活性，從而合成更多的分泌蛋白，因此相對低濃度的納米硒更有利于促進(jìn)雙孢菇正常的生長與代謝，從而合成更多的的含氮類物質(zhì)，而高濃度的納米硒則可能會誘導(dǎo)雙孢菇進(jìn)行脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的大量活性氧自由基會破壞雙孢菇的代謝酶系[23]，從而阻礙蛋白質(zhì)的合成，使含氮類物質(zhì)的含量有所降低。

2.3.4 粗脂肪

粗脂肪分析結(jié)果如表1所示，不同處理組的粗脂肪含量范圍為2.65 g/100 g DW（CK，對照）～3.54 g/100 g DW（T2，1.0 mg/kg），除T2（1.0 mg/kg）與T3（1.5 mg/kg）、T1（0.5 mg/kg）、T5（2.5 mg/kg）與CK（對照）間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。?ztürk等[27]研究發(fā)現(xiàn)雙孢菇中總飽和脂肪酸和總不飽和脂肪酸分別占總脂肪酸的20.28%和79.72%，其中亞油酸（67.29%）占主導(dǎo)地位。作為人體所必需的脂肪酸之一，亞油酸能夠降低血液中的膽固醇含量，并能夠通過影響脂質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物（血清甘油三酯、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白等）來降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[28]，同時(shí)亞油酸也能通過抑制胰島素抵抗相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸酶來發(fā)揮抗糖尿病作用[29]，基于上述研究，可以推斷出富含亞油酸的雙孢菇具有一定的藥用價(jià)值。從表1可以看出雙孢菇中粗脂肪的含量隨著納米硒處理濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明低濃度的納米硒更有利于雙孢菇在生長和代謝的過程中合成更多富含亞油酸的脂肪，從而提高雙孢菇的營養(yǎng)價(jià)值。

2.3.5 粗纖維

粗纖維分析結(jié)果如表1所示，不同處理組的粗纖維含量范圍為5.73 g/100 g DW（T5，2.5 mg/kg）～6.41 g/100 g DW（T2，1.0 mg/kg），除T2（1.0 mg/kg）與T3（1.5 mg/kg）、T4（2.0 mg/kg），T1（0.5 mg/kg），CK（對照）與T5（2.5 mg/kg）間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。吳圣進(jìn)等[24]測定的粗纖維范圍為6.6%～7.4%，高于本研究，可能是因?yàn)閮烧卟煌脑耘鄺l件和培養(yǎng)基質(zhì)等，雙孢菇中的纖維含量有所差異屬于正常范疇。

2.3.6 硒

微量元素硒分析結(jié)果如表1所示，不同處理組的硒含量范圍為0.08 mg/kg DW（CK，對照）～0.90 mg/kg DW（T5，2.5 mg/kg），且各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。根據(jù)中華人民共和國供銷合作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 1135-2017對于富硒農(nóng)產(chǎn)品的界定，當(dāng)食用菌類中的總硒含量在0.10 mg/kg DW～5.00 mg/kg DW范圍內(nèi)，方可標(biāo)識為富硒食用菌。本研究中除對照外，其他經(jīng)過不同濃度納米硒處理的雙孢菇樣品中的總硒含量在0.19 mg/kg DW～0.90 mg/kg DW之間，達(dá)到了富硒食用菌的標(biāo)準(zhǔn)要求。

從表1可以看出，隨著納米硒處理濃度的提高，雙孢菇中的硒含量逐漸上升，這與吳圣進(jìn)等[24]和施怡等[9]的研究結(jié)果基本相符。通過換算，不同處理的雙孢菇硒含量在7.96 μg/kg FW（CK，對照）～75.78 μg/kg FW（T5，2.5 mg/L），每人每天需要食用0.26 kg（T5，2.5 mg/L）～2.51 kg（CK，對照）左右的雙孢菇，即可滿足每人每天最低硒需要量（20 μg），由此可見富硒農(nóng)產(chǎn)品對于國民補(bǔ)硒的重要性。

表1 納米硒處理對雙孢菇子實(shí)體中基本成分的影響 Table 1 Effects of nano-selenium treatments on basic components in fruiting body of Agaricus bisporus

此外，本研究對照的硒含量為0.08 mg/kg DW，僅差0.02 mg/kg DW即可邁入天然富硒食用菌產(chǎn)品之列，可能原因在于本研究所用的禽類氮源、麥草等培養(yǎng)基質(zhì)含有較為可觀含量的硒，加上雙孢菇強(qiáng)大的硒富集能力，使得其不需要經(jīng)過富硒處理，總硒含量即可達(dá)到0.08 mg/kg DW。

2.3.7 游離氨基酸

雙孢菇子實(shí)體中游離氨基酸組成如表2所示，不同處理組的的游離氨基酸含量范圍為17.07 g/kg DW（CK，對照）～20.10 g/kg DW（T2，1.0 mg/kg），其中人體非必需氨基酸含量范圍為12.06 g/kg DW（CK，對照）～15.04 g/kg DW（T2，1.0 mg/kg），必需氨基酸含量范圍為4.94 g/kg DW（T1，0.5 mg/kg）～5.27 g/kg DW（T3，1.5 mg/kg）。

表2 納米硒處理對雙孢菇子實(shí)體中游離氨基酸組成的影響 Table 2 Effects of nano-selenium treatments on free amino acid compositions in fruiting body of Agaricus bisporus

Pei等[22]測定的雙孢菇鮮菇中的游離氨基酸含量為44.2 mg/g DW，經(jīng)過冷凍干燥1、3、5、6.5、8 h處理的雙孢菇中的游離氨基酸含量分別為44.6、45.3、48.9、31.8、24.3 mg/g DW，經(jīng)過微波真空干燥5.15 h處理的雙孢菇中的游離氨基酸含量分別為42.0 mg/g DW，很明顯雙孢菇經(jīng)過不同的處理后，其中所含的游離氨基酸含量均不相同，尤其當(dāng)冷凍干燥時(shí)間達(dá)到8 h后游離氨基酸含量會大大降低。本研究所測得的雙孢菇子實(shí)體中游離氨基酸含量相對偏小，可能原因在于本研究是在108 ℃下將雙孢菇子實(shí)體鮮樣烘干至恒重，時(shí)間在12 h左右，可能是過高的烘干溫度以及偏長的烘干時(shí)間促進(jìn)了氨基酸與還原糖之間的美拉德反應(yīng)，當(dāng)然，也有可能是在烘干的過程中引發(fā)了氨基酸的史崔克降解，從而使雙孢菇子實(shí)體中游離氨基酸含量大大降低[30,31]。

從表2可以看出，當(dāng)納米硒處理濃度為1.0 mg/kg時(shí)，雙孢菇子實(shí)體中游離氨基酸中的人體非必需氨基酸最多，當(dāng)納米硒處理濃度為1.5 mg/kg時(shí)，雙孢菇子實(shí)體中游離氨基酸中的人體必需氨基酸最多，但就雙孢菇子實(shí)體中總游離氨基酸而言，納米硒處理濃度為1.0 mg/kg的效果優(yōu)于1.5 mg/kg。

2.3.8 總氨基酸

雙孢菇子實(shí)體中總氨基酸組成如表3所示，不同處理組的總氨基酸含量范圍為261.11 g/kg DW（T5，2.5 mg/kg）～287.19 g/kg DW（T2，1.0 mg/kg），其中人體非必需氨基酸含量范圍為169.39 g/kg DW（CK，對照）～184.63 g/kg DW（T2，1.0 mg/kg），必需氨基酸含量范圍為91.18 g/kg DW（T5，2.5 mg/kg）～102.56 g/kg DW（T2，1.0 mg/kg）。

表3 納米硒處理對雙孢菇子實(shí)體中總氨基酸組成的影響 Table 3 Effects of nano-selenium treatments on total amino acid compositions in fruiting body of Agaricus bisporus

Prange等[10]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)亞硒酸鹽處理后雙孢菇中Se-(甲基)硒基-L-半胱氨酸（Se-MeSeCys）、硒代蛋氨酸（Se-Met）和亞硒酸鉀的含量分別占總硒含量的55%、35%、10%；Maseko等[32]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用水灌溉的雙孢菇/用亞硒酸鈉溶液灌溉的雙孢菇的帽部和莖部硒代氨基酸含量最大值分別為：硒代半胱氨酸（Se-Cys）為4.16/9.65 μg/g DW，Se-Met為0.08/0.58 μg/g DW，Se-MeSeCys為0.031/0.10 μg/g DW。以上研究表明雙孢菇強(qiáng)大的硒富集能力以及硒有機(jī)轉(zhuǎn)化能力，并能夠在較大程度上轉(zhuǎn)化為更易于人體吸收代謝的硒代氨基酸。盡管本研究并沒有研究經(jīng)納米硒處理后雙孢菇中硒的形態(tài)特征，但有趣的是，雙孢菇子實(shí)體中總氨基酸組成中蛋氨酸含量隨著納米硒處理濃度的增加而不斷下降，而半胱氨酸含量隨著納米硒處理濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能原因在于在納米硒處理濃度≤1.5 mg/kg時(shí)，能夠促進(jìn)雙孢菇的生長代謝，從而使其生成半胱氨酸的速率遠(yuǎn)高于半胱氨酸轉(zhuǎn)化為Se-Cys和Se-MeSeCys的速率，導(dǎo)致半胱氨酸含量隨納米硒處理濃度的增加而上升，當(dāng)納米硒處理濃度達(dá)到2.5 mg/kg時(shí)，較高濃度的硒干擾了雙孢菇自身正常的生長代謝，使其生成半胱氨酸的速率遠(yuǎn)低于半胱氨酸轉(zhuǎn)化為Se-Cys和Se-MeSeCys的速率，導(dǎo)致半胱氨酸含量急劇降低。

此外，經(jīng)亞硒酸鹽處理后雙孢菇通過自身的代謝更偏向于將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為Se-Cys或Se-MeSeCys，而與之不同的是，經(jīng)納米硒處理后雙孢菇通過自身的代謝可能更偏向于將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為Se-Met，從而使其中的蛋氨酸含量隨著納米硒處理濃度的增加而不斷降低。另外，從表3可以很明顯看出，無論是雙孢菇子實(shí)體中總氨基酸中的人體非必需氨基酸和必需氨基酸含量，還是雙孢菇子實(shí)體中總氨基酸含量，納米硒處理濃度為1.0 mg/kg的效果最優(yōu)。

2.4 納米硒對雙孢菇子實(shí)體單朵均重的影響

在雙孢菇子實(shí)體單朵均重方面，如表4所示，不同處理組的單朵均重范圍為20.50 g（T5，2.5 mg/kg）～22.90 g（T2，1.0 mg/kg），除T2（1.0 mg/kg）與T3（1.5 mg/kg）、T3（1.5 mg/kg）與T4（2.0 mg/kg）、T4（2.0 mg/kg），T1（0.5 mg/kg），CK（對照）與T5（2.5 mg/kg）間無顯著差異（p＞0.05）外，其余各樣品間均有顯著差異（p＜0.05）。吳圣進(jìn)等[24]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在覆土中添加亞硒酸鈉能夠在一定程度上提高雙孢菇子實(shí)體的產(chǎn)量，本研究也有類似之處，納米硒處理濃度為1.0 mg/kg和1.5 mg/kg時(shí)的雙孢菇子實(shí)體單朵均重均顯著高于對照，說明施用適量的納米硒能夠促進(jìn)雙孢菇的生長，獲得增產(chǎn)效果，可能是因?yàn)樵诘臀貐^(qū)，施用適量的硒能夠提高雙孢菇中多種抗氧化酶的活性，使其體內(nèi)抗氧化能力增強(qiáng)，并清除其中多余的不利于雙孢菇生長代謝的脂質(zhì)過氧化物，從而增強(qiáng)了雙孢菇的抗衰老能力和抗逆性，提高了雙孢菇生長性能，導(dǎo)致雙孢菇子實(shí)體單朵均重顯著提高[33]。

表4 納米硒處理對單朵雙孢菇子實(shí)體均重的影響 Table 4 Effects of nano-selenium treatments on average weight of each fruiting body of Agaricus bisporus

2.5 納米硒對雙孢菇保藏期的影響

不同濃度納米硒處理對雙孢菇子實(shí)體保藏期的影響如圖3所示，對照組的雙孢菇子實(shí)體隨著保藏時(shí)間的延長，褐變程度越來越深，而低濃度納米硒處理組的雙孢菇子實(shí)體隨著保藏時(shí)間的延長，褐變程度不明顯，但高濃度納米硒處理組的雙孢菇子實(shí)體，尤其是2.5 mg/kg納米硒處理組的雙孢菇子實(shí)體，從采摘后所呈現(xiàn)的微微發(fā)紅的狀態(tài)尤為明顯，改變了雙孢菇子實(shí)體顏色潔白的固有性狀，可能原因在于納米硒本身的顏色為橙色或紅色，高濃度納米硒處理組的雙孢菇子實(shí)體吸收了大量的納米硒，高濃度納米硒抑制了其正常的生長代謝，使得其吸收的紅色納米硒未能全部轉(zhuǎn)化為無色的有機(jī)硒，導(dǎo)致剩余未能成功轉(zhuǎn)化的紅色納米硒分散在雙孢菇子實(shí)體中，使雙孢菇子實(shí)體呈現(xiàn)微紅的狀態(tài)。

雙孢菇發(fā)生褐變的主要原因有酶促褐變（包括多酚氧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶等）、自身衰老（活性氧的積累是主要原因之一）和腐敗微生物。本研究采用的是低溫保藏，低溫能夠抑制氧化酶類的活性和腐敗微生物的活性、降低雙孢菇的代謝速率以及減少活性氧的積累，從而延緩了雙孢菇子實(shí)體的褐變進(jìn)度[34]，以致于保藏6 d的對照組的雙孢菇子實(shí)體的褐變程度適中，而低濃度納米硒處理組的雙孢菇子實(shí)體褐變不明顯，除了低溫保藏的緣故，可能也因?yàn)殡p孢菇子實(shí)體適量濃度的硒提高了雙孢菇子實(shí)體中多種依賴硒的抗氧化酶的活性，增強(qiáng)了雙孢菇子實(shí)體的抗氧化能力，并清除了相當(dāng)一部分會使雙孢菇子實(shí)體衰老的活性氧，并且作為軟模板的殼聚糖具有防腐殺菌的作用，可以起到抑制甚至殺死腐敗微生物的作用。因此，在多方面因素的協(xié)同作用下，低濃度納米硒處理組的雙孢菇子實(shí)體褐變不明顯，其保藏期也得到了較大的延長，有利于雙孢菇的貯藏、貨運(yùn)與售賣[11,15,33,34]。

從6 d的觀察和圖3來看，低濃度納米硒處理組的雙孢菇子實(shí)體保藏期更長，其中尤以1.0 mg/kg納米硒處理組的最為明顯，相較于對照組，其保藏期至少能夠延長1～2 d。

2.6 聚類分析

對不同濃度納米硒處理的雙孢菇子實(shí)體中的8種基本成分（水分、粗多糖、總氮、粗脂肪、粗纖維、硒、總游離氨基酸、總氨基酸）和單朵均重進(jìn)行系統(tǒng)的聚類分析，采用平方Euclidean距離為度量準(zhǔn)則，得到聚類分析如圖4所示。

當(dāng)距離大于10小于25時(shí)，樣品可分為2類；當(dāng)距離大于5小于10時(shí)，可將不同濃度納米硒處理的雙孢菇子實(shí)體很好地分為3大類，其中T2（1.0 mg/kg）為第1類，T3（1.5 mg/kg）和T1（0.5 mg/kg）為第2類，T5（2.5 mg/kg）、T4（2.0 mg/kg）和CK（對照）為第3類。結(jié)合具體數(shù)據(jù)與分析可知，根據(jù)綜合的基本成分含量和單朵雙孢菇子實(shí)體均重進(jìn)行排序?yàn)椋旱?類＞第2類＞第3類，也即1.0 mg/kg的納米硒處理的雙孢菇子實(shí)體綜合品質(zhì)更好，且單朵均重更大。

2.7 主成分分析

對測定所得到的包括基本成分（水分、粗多糖、總氮、粗脂肪、粗纖維、硒、總游離氨基酸、總氨基酸）和單朵均重這9個(gè)變量的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，為了保證信息的完整性和可靠性，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率應(yīng)該達(dá)到80%以上，結(jié)果見表5、表6、表7。

表5 主成分的初始特征值及累積方差貢獻(xiàn)率 Table 5 Initial eigenvalue and cumulative variance contribution rate of principal components

由表5可知，前兩個(gè)主成分的特征值均大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為96.267%，故提取了前兩個(gè)主成分。其中，第1主成分（PC1）的特征值是6.457，是最重要的，解釋71.750%的變異，如表6所示，粗多糖、總氮、粗脂肪、粗纖維、總游離氨基酸、總氨基酸和單朵均重在PC1上有較高的載荷，分別為0.981、0.886、0.843、0.958、0.939、0.974和0.978，說明第1主成分基本反映了這些指標(biāo)的信息；第2主成分（PC2）的特征值是2.207，解釋24.517%的變異，如表6所示，水分和硒在PC2上有較高的載荷，分別為0.833和0.980，說明第2主成分基本反映了水分和硒的信息。由于提取前兩個(gè)主成分可以基本反映全部指標(biāo)的信息，因此決定用2個(gè)新變量（PC1和PC2）來代替原來的9個(gè)變量。通過計(jì)算得出PC1得分、PC2得分和綜合得分，如表7所示，結(jié)果表明，T2（1.0 mg/kg）綜合得分排名第一，其次是T3（1.5 mg/kg）、T4（2.0 mg/kg）、T1（0.5 mg/kg）、CK（對照）和T5（2.5 mg/kg）。

表6 前2個(gè)主成分的變異來源 Table 6 Variation source for first two principal components (PC1 & PC2)

表7 不同處理的主成分得分和綜合得分 Table 7 Main component score and comprehensive score of different treatments

3 結(jié)論

本研究以殼聚糖為模板，化學(xué)法制備納米硒，呈現(xiàn)為規(guī)則球形狀態(tài)，平均粒徑為52 nm，性質(zhì)均一穩(wěn)定。在雙孢菇栽培過程中，通過在培養(yǎng)基中添加濃度為1.0 mg/kg干基的納米硒，可以提升雙孢菇子實(shí)體的綜合營養(yǎng)品質(zhì)，顯著提高雙孢菇子實(shí)體中的硒含量，使其達(dá)到中華人民共和國供銷合作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的富硒食用菌標(biāo)準(zhǔn)，最長可延長雙孢菇的保藏期2 d。本研究為富硒雙孢菇的研發(fā)提供了重要參考，為納米硒產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支撐和理論借鑒。