中國菰米與稻米甲醇提取物體外酶抑制作用分析

于秀婷，祁倩倩，李亞麗，楊永義，楊婷，袁源，杜詠梅，劉新民，張忠鋒，閆寧*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東 青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東 濟(jì)南 250100）

菰屬植物（Zizania spp.）屬禾本科（Gramineae）、稻族（Oryzeae Dumort）、菰亞族（Zizaniinae Benth）[1]。世界上的菰屬植物共有4種，包括東亞的中國菰（Zizania latifolia）以及北美洲的水生菰（Zizania aquatica）、沼生菰（Zizania palustris）和得克薩斯菰（Zizania texana）[2]。中國菰可生長于湖泊、溝塘、河溪和濕地中，在淮河流域和長江流域中下游分布最為廣泛[3-4]。中國菰種子經(jīng)人工或機(jī)械方法去殼后得到的穎果為中國菰米（Chinese wild rice），是一種富含酚類化合物，尤其是類黃酮化合物的有色全谷物[5-6]。研究表明，菰米可改善高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠胰島素抵抗，降低高脂膳食誘導(dǎo)的低密度脂蛋白受體敲除小鼠的高血糖，還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[7-9]。水稻（Oryza sativa）與中國菰為近緣屬，稻米主要分為秈稻和粳稻兩個(gè)亞種[10-11]。稻米根據(jù)種皮顏色還可分為無色稻米和有色稻米，有色稻米種皮由于類黃酮的積累，呈紅色、黑色等顏色，同時(shí)含有更豐富的生物活性物質(zhì)[12]。糙米、紅米和黑米僅脫去了外層的穎殼，和中國菰米一樣都屬于全谷物食品的范疇。居民日常膳食中適當(dāng)添加有色稻米或糙米，可以起到預(yù)防脂肪肝、高血糖和高血脂等慢性疾病的效果[13-14]。

近年來，許多研究闡述了酚類化合物對(duì)糖尿病和多種代謝性疾病的作用機(jī)制。中國菰米作為富含類黃酮化合物的傳統(tǒng)食品資源，目前還沒有文章較為全面地研究過其對(duì)糖尿病和其他代謝疾病相關(guān)酶活性的抑制效果。因此，本文以已知的有效酶抑制劑為陽性對(duì)照，主要研究了中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶的抑制作用，及抑制作用與酚類化合物含量的相關(guān)性，從而系統(tǒng)地比較中國菰米與稻米對(duì)多種慢性疾病相關(guān)酶活性抑制作用的差異，探究中國菰米和不同種類稻米的提取物在抗衰老、預(yù)防和輔助治療糖尿病、肥胖等慢性疾病方面的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國菰米和不同種類稻米（秈米、粳米、紅米、黑米）于2019年10月采自湖北省荊州市三湖農(nóng)場(chǎng)和江蘇省淮安市金湖縣白馬湖村，2018年也在兩地收集了中國菰米樣品[1]。所有樣品進(jìn)行去除穎殼、不去除種皮處理。樣品經(jīng)真空冷凍干燥至恒重；利用粉碎機(jī)粉碎至粉末狀，每個(gè)樣品有3個(gè)重復(fù)。

α-葡萄糖苷酶（11.05 U/mg）、α-淀粉酶（11 U/mg）、可溶性淀粉、胰脂肪酶（30 U/mg～90 U/mg）、酪氨酸酶（7 164 U/mg）、左旋多巴、曲酸：美國 Sigma公司；對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；拜糖平（阿卡波糖）：中國北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司；4-硝基苯丁酸酯（p-Nitrophenyl butyrate，PNPB）、奧利司他：上海麥克林生化科技有限公司；DNS試劑：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)（Alpha 1-4 LDPlus）：德國Marin Christ公司；粉碎機(jī)（FDV-SS）：弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司；超聲波恒溫清洗機(jī)（SBL-30DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；離心機(jī)（Eppendorf AG 22331 Hamburg）：德國Eppendorf公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE100-Pro）：美國 Scilogex公司；光吸收型全波長酶標(biāo)儀（SP-Max 2300A2）：上海閃譜生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取與制備

樣品提?。簠⒖糦u等[1]的方法，采用超聲波輔助提取法進(jìn)行樣品提取。分別稱取0.2 g（精確至0.000 1）中國菰米和4種稻米樣品粉末加入5 mL甲醇后在超聲萃取儀中50℃超聲萃取40 min，3 500 r/min離心10 min后吸取上清液并用0.22 μm極性膜過濾，制得游離態(tài)酚類樣品液。向剩余濾渣中加入5 mL濃度為4 mol/L的NaOH溶液，于恒溫振蕩器中30℃230 r/min振蕩水解4 h。隨后在4 500 r/min下離心10 min，收集上清液。用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH值至1.5～2.0，用乙酸乙酯萃取3次后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35℃蒸發(fā)至干，加入5 mL甲醇溶液超聲復(fù)溶，過0.22 μm極性膜，得到結(jié)合態(tài)酚類提取液。提取液均于4℃條件儲(chǔ)存。

樣品制備：吸取等量游離態(tài)酚類提取液和結(jié)合態(tài)酚類提取液渦旋混勻，取5 mL混合液于45℃氮吹至干，加入1 mL DMSO復(fù)溶配制成100 mg/mL儲(chǔ)備液，于4℃條件儲(chǔ)存。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制作用

儲(chǔ)備液用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS，pH6.9）稀釋 20 倍后得到供測(cè)樣品液，反應(yīng)體系在Chu等[15]建立的方法上加以改進(jìn)。用NaCl PBS（6.7 mmol/L）配制 α-葡萄糖苷酶（0.25 U/mL）。陽性對(duì)照阿卡波糖濃度為1 mg/mL。反應(yīng)在96細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，將70 μL供測(cè)樣品溶液和10 μL α-葡萄糖苷酶溶液充分振蕩混勻后于37℃恒溫箱中孵育10 min。加入 20 μL PNPG（6 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混勻后于37℃恒溫箱中孵育20min。加入100μL 1mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，充分振蕩混勻于400 nm波長下測(cè)定吸光度。按照下式計(jì)算抑制率。

式中：A樣品為添加供測(cè)樣品反應(yīng)液的吸光度；A空白代表未添加樣品反應(yīng)液（以PBS稀釋的5%DMSO替代）的吸光度；A背景為不含α-葡萄糖苷酶（以NaCl PBS替代）的背景溶液吸光度（1為添加樣品，2為未添加樣品）。

1.3.3 α-淀粉酶抑制作用

儲(chǔ)備液用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.9）稀釋20倍后得到供測(cè)樣品液，反應(yīng)體系在Yuan等[16]建立的方法上加以改進(jìn)。陽性對(duì)照阿卡波糖濃度為0.005 mg/mL。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液制備可溶性淀粉溶液（1%，質(zhì)量比）和α-淀粉酶溶液（0.5 U/mL）。反應(yīng)在2 mL離心管中進(jìn)行，將100 μL樣品溶液與40 μL α-淀粉酶充分混合后在37℃下孵育10 min。向離心管中添加100 μL可溶性淀粉溶液，孵育10 min。加入200 μL DNS試劑停止反應(yīng)，并在100℃保溫5 min。將所得混合物冷卻至室溫，加入1.5 mL超純水稀釋，于520 nm下測(cè)量吸光度。按照下式計(jì)算抑制率。

式中：A樣品為添加供測(cè)樣品反應(yīng)液的吸光度；A空白代表未添加樣品反應(yīng)液（以PBS稀釋的5%DMSO替代）的吸光度；A背景為不含α-淀粉酶（以NaCl PBS替代）的背景溶液吸光度（1為添加樣品，2為未添加樣品）。

1.3.4 胰脂肪酶抑制作用

儲(chǔ)備液用0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（Tris-HCl，pH8.0）稀釋 20倍后得到供測(cè)樣品液，反應(yīng)體系在已建立的方法[16-17]上加以改進(jìn)。以0.5 mg/mL奧利司他為陽性對(duì)照。向96細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL供測(cè)樣品溶液和50 μL胰脂肪酶Tris-HCl溶液（0.5 mg/mL），充分振蕩混勻后于37℃恒溫箱中孵育10 min。加入50 μL 4-硝基苯丁酸酯Tris-HCl溶液（15 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混勻后37℃恒溫孵育20 min，于400 nm波長下測(cè)定吸光度。按照下式計(jì)算抑制率。

式中：A樣品為添加供測(cè)樣品反應(yīng)液的吸光度；A空白代表未添加樣品反應(yīng)液（以Tris-HCl稀釋的5%DMSO替代）的吸光度；A背景為不含胰脂肪酶（以Tris-HCl替代）的背景溶液吸光度（1為添加樣品，2為未添加樣品）。

1.3.5 酪氨酸酶抑制作用

儲(chǔ)備液用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.8）稀釋20倍后得到供測(cè)樣品液，反應(yīng)體系在Yuan等[16]建立的方法上加以改進(jìn)。以0.005 mg/mL曲酸為陽性對(duì)照。反應(yīng)在96細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，將70 μL樣品溶液與50 μL酪氨酸酶（50 U/mL）混合后在25℃下孵育10 min，然后添加80 μL 0.5 mmol/L左旋多巴（溶于0.05 mol/L PBS）啟動(dòng)反應(yīng)。充分混勻在25℃下孵育20 min后，于475 nm處測(cè)量吸光度。按照下式計(jì)算抑制率。

式中：A樣品為添加供測(cè)樣品反應(yīng)液的吸光度；A空白代表未添加樣品反應(yīng)液（以PBS稀釋的5%DMSO替代）的吸光度；A背景為不含酪氨酸酶（以PBS替代）的背景溶液吸光度（1為添加樣品，2為未添加樣品）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)為3次獨(dú)立重復(fù)。運(yùn)用 SAS v.9.4（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用鄧肯法多重比較對(duì)樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在P＜0.05下進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析。Pearson相關(guān)分析在P＜0.05水平進(jìn)行數(shù)據(jù)間相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用

中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率如圖1所示。

圖1 中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on α-glucosidase activity

由圖1可知，1 mg/mL阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶活性抑制率為（65.54±1.05）%。12個(gè)樣品中，荊州黑米和淮安黑米甲醇提取物表現(xiàn)出最強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，抑制率分別為（93.23±4.78）%和（87.39±3.81）%，顯著高于陽性對(duì)照阿卡波糖（P＜0.05）。此外，荊州產(chǎn)地2018年、2019年中國菰米以及荊州紅米對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用雖然低于同產(chǎn)地黑米和陽性對(duì)照，但相較于同產(chǎn)地的秈米、粳米也表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制作用，抑制率分別為（22.80±0.06）%、（22.03±0.31）%和（14.53±0.29）%。淮安產(chǎn)地2018年中國菰米的α-葡萄糖苷酶活性抑制率為（11.53±0.39）%，顯著高于同產(chǎn)地除黑米外的其他樣品?；窗伯a(chǎn)地秈米、粳米、紅米、2019年中國菰米的α-葡萄糖苷酶酶活性抑制率之間無顯著性差異。荊州產(chǎn)地紅米、黑米、2018年和2019年中國菰米的α-葡萄糖苷酶活性抑制率分別為秈米的3.19、20.48、5.01和4.84倍，粳米的 3.07、19.69、4.82 和 4.65倍，種皮顏色深的樣品相比種皮無顏色的樣品呈現(xiàn)出更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力。

中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率如圖2所示。

圖2 中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on α-amylase activity

由圖2可知，本試驗(yàn)12個(gè)樣品的α-淀粉酶活性抑制率均顯著低于0.005 mg/mL阿卡波糖的（38.67±0.47）%（P＜0.05）。荊州黑米的 α-淀粉酶活性抑制率為（22.50±0.76）%，顯著高于同產(chǎn)地秈米、粳米以及2018年、2019年中國菰米（P＜0.05）。荊州粳米的α-淀粉酶活性抑制率僅為（7.44±0.37）%，為同產(chǎn)地樣品最低?；窗埠诿椎摩?淀粉酶活性抑制率為（22.34±2.15）%，顯著高于同產(chǎn)地的其他樣品（P＜0.05）。淮安紅米與淮安2019年中國菰米的α-淀粉酶活性抑制率分別為（18.28±1.14）%和（16.53±0.91）%，兩者之間無顯著差異，但均顯著高于淮安秈米和淮安粳米的（5.00±2.76）%和（12.13±0.38）%（P＜0.05）。

2.2 中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制作用

中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率如圖3所示。

圖3 中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on pancreatic lipase activity

由圖3可知，陽性對(duì)照奧利司他（0.5 mg/mL）的胰脂肪酶活性抑制率為（83.08±5.57）%，所有12個(gè)樣品對(duì)胰脂肪酶均有一定的抑制作用，但抑制率均顯著小于陽性對(duì)照（P＜0.05）。荊州產(chǎn)地秈米、粳米、紅米、黑米、2018年和2019年中國菰米胰脂肪酶活性抑制率分 別 為 （16.87±4.44）% 、（16.04±0.94）% 、（23.25±1.03）%、（35.54±3.13）%、（19.53±0.46）%和 （18.75±1.43）%?；窗伯a(chǎn)地秈米、粳米、紅米、黑米、2018年和2019年中國菰米胰脂肪酶活性抑制率分別為（18.30±0.35）% 、（16.54 ±0.05）% 、（23.16 ±0.91）% 、（29.40 ±1.25）%、（20.59±4.04）%和（21.25±4.09）%。所有樣品中，黑米對(duì)胰脂肪酶的抑制率顯著高于同地區(qū)其他樣品（P＜0.05），中國菰米樣品與秈米、粳米和紅米間并無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率如圖4所示。

圖4 中國菰米與稻米甲醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on tyrosinase activity

由圖4可知，12個(gè)樣品中黑米的酪氨酸酶活性抑制率最高，荊州黑米和淮安黑米的酪氨酸酶活性抑制率分別為（58.78±1.74）%和（47.19±0.57）%，顯著高于陽性對(duì)照 0.005 mg/mL 曲酸的 （38.18±3.31）%（P＜0.05）。荊州2018年和2019年中國菰米的酪氨酸酶活性抑制率分別為（35.29±0.08）%和（34.72±1.83）%，淮安2018年和2019年中國菰米的酪氨酸酶活性抑制率分別為（31.50±0.62）%和（30.27±0.76）%。同產(chǎn)地中國菰米、紅米、黑米與無色稻米甲醇提取物的酪氨酸酶活性抑制率表現(xiàn)為黑米＞中國菰米＞紅米＞無色稻米，且兩地區(qū)樣品間差異規(guī)律相似。與荊州樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制率規(guī)律相同，種皮顏色較深的黑米、中國菰米、紅米較無色的秈米、粳米表現(xiàn)出更強(qiáng)的酪氨酸酶活性抑制能力。

2.4 中國菰米和稻米體外酶抑制作用與總酚、總黃酮、總原花青素含量的相關(guān)性分析

中國菰米與稻米體外酶抑制作用與總酚含量（total phenolic content，TPC）、總黃酮含量（total flavonoid content，TFC）、總原花青素（total proanthocyanidin content，TPAC）含量的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。

表1 中國菰米與稻米體外酶抑制作用與總酚、總黃酮、總原花青素含量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa on enzymesin in vitro and the content of total phenols，total flavonoids，and total proanthocyanidins

TPC、TFC、TPAC數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)[1]所測(cè)得的中國菰米和稻米總酚、總黃酮、和總原花青素含量。中國菰米和稻米 TPC（R=0.642 9、0.599 3、0.461 5、0.814 5，P＜0.05）、TFC （R=0.597 1、0.666 6、0.585 0、0.854 2，P ＜0.01）、TPAC （R=0.935 8、0.645 9、0.826 7、0.924 3，P＜0.01）均與其對(duì)4種酶體外酶抑制作用呈顯著的線性正相關(guān)，推測(cè)總酚、總黃酮和總原花青素含量是影響中國菰米和稻米體外酶活性抑制作用的重要因素。

3 討論與結(jié)論

樣品濃度為5 mg/mL時(shí)，荊州和淮安黑米的α-葡萄糖苷酶活性抑制率可達(dá)（93.23±4.78）%和（87.39±3.81）%，酪氨酸酶活性抑制率可達(dá)（58.78±1.74）%和（47.19±0.57）%，遠(yuǎn)高于其他樣品，且已經(jīng)高于試驗(yàn)中的陽性對(duì)照阿卡波糖（1 mg/mL）和曲酸（0.005 mg/mL）。中國菰米的α-葡萄糖苷酶活性和酪氨酸酶活性抑制率在7.40%～22.80%和30.27%～35.29%，顯著高于紅米和無色稻米（圖1和圖4）（P＜0.05）。中國菰米與稻米的α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性抑制率大小表現(xiàn)為黑米＞中國菰米＞紅米＞無色稻米，趨勢(shì)與Yu等[1]所測(cè)的中國菰米和稻米總酚、總黃酮、總原花青素含量相似。相關(guān)性分析表明，總酚、總黃酮和總原花青素含量與中國菰米和稻米體外酶抑制率呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。Chu等[15]指出從中國菰米中分離得到的不同原花青素組分表現(xiàn)出不同程度的α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制作用。Yao等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)在紅米、紫米、黑米、紫玉米、黑色大麥和黑色大豆中，黑米的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最強(qiáng)，而且α-葡萄糖苷酶活性抑制作用與總酚和總花青素含量呈顯著正相關(guān)。還有研究表明，藻類酚類化合物對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶均有良好的抑制作用，尤其是對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用優(yōu)于阿卡波糖[16]。

與α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶相比，中國菰米和稻米的α-淀粉酶和胰脂肪酶活性抑制率之間差異更小。與本研究結(jié)果類似的是，Boue等[19]研究了5種有色稻米米糠的乙醇提取物，結(jié)果顯示5個(gè)樣品總酚、總黃酮、總原花青素含量雖然存在不同程度差異，但并不是所有樣品提取物的α-淀粉酶抑制能力都與酚類化合物總含量相關(guān)。Chu等[15]的研究結(jié)果顯示，中國菰米中分離出的6個(gè)原花青素組分僅有一個(gè)聚合度較高的組分展現(xiàn)出弱胰脂肪酶抑制作用（IC50=1 054.01 μg/mL），并推測(cè)植物提取物的胰脂肪酶抑制作用不僅與酚類化合物的總量有關(guān)，還與分子類型有關(guān)。荊州菰米、淮安菰米和紅米富含蘆?。?03.7 μg/g～ 15.7 μg/g）和槲皮素（15.4 μg/g～ 44.1 μg/g），而且已有研究表明槲皮素和蘆丁均為α-葡萄糖苷酶的有效抑制劑[4，20]。荊州中國菰米與黑米的α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制率顯著高于同產(chǎn)地的秈米和粳米，可能與其提取物中的相關(guān)類黃酮單體含量更高有關(guān)。

綜上所述，中國菰米與4種稻米的甲醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶均具有一定的抑制作用，其中黑米的α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性抑制率分別顯著高于1 mg/mL阿卡波糖和0.005 mg/mL曲酸陽性對(duì)照。荊州中國菰米的α-葡萄糖苷酶活性和酪氨酸酶活性抑制率也要顯著高于同產(chǎn)地的紅米、秈米和粳米。黑米的胰脂肪酶活性抑制率顯著高于同地區(qū)其他樣品。相關(guān)性分析顯示，中國菰米與4種稻米的酶活性抑制作用與總酚、總黃酮、總原花青素含量，尤其是總黃酮和總原花青素含量密切相關(guān)。本研究證實(shí)了中國菰米與4種稻米的甲醇提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶的成分，所獲得結(jié)果為中國菰米與稻米在糖尿病和其他代謝疾病相關(guān)酶的抑制作用方面提供了參考。