134例生長(zhǎng)受限胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

侯 磊 王小新 劉麗恒 張為遠(yuǎn) 王 欣

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院產(chǎn)科， 北京 100026)

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是指各類原因所導(dǎo)致的胎兒體質(zhì)量低于同孕齡平均體質(zhì)量第10百分位數(shù)或低于同孕齡平均體質(zhì)量的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。國(guó)內(nèi)外研究[1-2]報(bào)道FGR的發(fā)生率為3%～10%，F(xiàn)GR胎兒的圍產(chǎn)期病死率較高，不僅在孕期可能出現(xiàn)死胎，出生后新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)、低體溫、腦出血及智力障礙等遠(yuǎn)近期并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加。

FGR的病因很復(fù)雜，可以簡(jiǎn)要?dú)w結(jié)為母體、胎兒和胎盤三大因素，胎兒因素又稱為內(nèi)因性FGR，包括染色體病、基因病、病毒感染等胎兒本身因素所導(dǎo)致的FGR。對(duì)于FGR胎兒的非整倍體研究已非常廣泛，以往研究[3]顯示，19%的FGR是由于染色體病導(dǎo)致的，約90%的18-三體、30%的21-三體胎兒有FGR表現(xiàn)，Yaegash等[4]報(bào)道了39.2%的Turner綜合征可伴發(fā)胎兒生長(zhǎng)受限，Snijders等[5]的研究顯示26周前三倍體是導(dǎo)致FGR的最常見(jiàn)的染色體異常，而26周后最常見(jiàn)的染色體異常為18-三體。18-三體、21-三體和Turner綜合征是除了三倍體以外最常見(jiàn)的導(dǎo)致妊娠早期FGR合并胎兒畸形的非整倍體。

近年來(lái)，隨著染色體技術(shù)的不斷發(fā)展，研究[6]顯示基因拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)是基因組疾病中最常見(jiàn)的類型，主要的臨床特征除內(nèi)臟器官畸形外，尚合并智力發(fā)育異常、精神行為改變等。國(guó)內(nèi)外研究[7]顯示，對(duì)超聲異常胎兒的致病性CNV檢出率達(dá)6.0%～27.4%，有極高的臨床意義，鑒于此，母胎醫(yī)學(xué)及基因?qū)W會(huì)指南[8]建議，胎兒存在一種以上結(jié)構(gòu)異常建議常規(guī)行CNVs檢測(cè)。以往的研究[9]還顯示，半數(shù)以上的病理性CNVs的孩子在胎兒期表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，因此，對(duì)于FGR胎兒進(jìn)行CNVs檢測(cè)將在很大程度上減少染色體病胎兒的出生。本文對(duì)134例FGR胎兒進(jìn)行了核型聯(lián)合低覆蓋度大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(copy number variation sequencing, CNV-seq)的檢測(cè)，以明確生長(zhǎng)受限胎兒CNV的檢出率。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

將2013年1月1日至2016年12月31日間來(lái)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診，胎兒超聲提示胎兒生長(zhǎng)受限并知情同意接受產(chǎn)前診斷的134例孕婦作為研究對(duì)象，孕周18～32周，中位數(shù)孕周為25周。產(chǎn)前診斷的方法包括羊水穿刺102例，臍血穿刺30例，流產(chǎn)物送檢2例。 胎兒生長(zhǎng)受限診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《胎兒生長(zhǎng)受限專家共識(shí)》[10]。孕婦術(shù)前常規(guī)遺傳咨詢并簽署知情同意書。本研究利用的研究信息不含有使受試者的身份被直接識(shí)別或通過(guò)與其相關(guān)的識(shí)別物識(shí)別的信息，屬于免除倫理審查。

1.2 資料收集

收集研究對(duì)象的一般情況、指征、血清篩查結(jié)果、遺傳室結(jié)果、超聲結(jié)果等。羊水穿刺、臍帶血穿刺及絨毛穿刺均由本院產(chǎn)前診斷中心完成，送檢單位為本院遺傳實(shí)驗(yàn)室。羊水診斷：妊娠18～23+6周經(jīng)腹羊膜腔穿刺取羊水30 mL。臍血診斷：妊娠24周后經(jīng)腹臍靜脈穿刺取血2 mL。所有介入性產(chǎn)前診斷均在超聲定位下進(jìn)行，按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片及核型分析。

1.3 基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)

將50 ng基因組 DNA進(jìn)行片段化處理，獲得大小為 300 bp的DNA片段，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)[11-12]，使用 Illumina公司的HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，36 bp單端測(cè)序，測(cè)序深度0.1倍，產(chǎn)生800萬(wàn)條的測(cè)序序列。使用Burrows-Wheeler算法將所有測(cè)序序列與hg19基因組進(jìn)行比對(duì)分析[13]。根據(jù)文獻(xiàn)[14]記載的數(shù)據(jù)處理和分析算法，將最少20個(gè)測(cè)試樣本進(jìn)行內(nèi)部比較，互相作為參考。以60 kb為基本測(cè)序單元，對(duì)大約500萬(wàn)條測(cè)序序列進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)序讀取密度的log2值為y軸，以相對(duì)連續(xù)的60 kb測(cè)序單元為x軸，繪制CNV-seq檢測(cè)結(jié)果圖。然后，依據(jù)每條染色體的長(zhǎng)度計(jì)算log2平均值。

數(shù)據(jù)經(jīng)查詢DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及Pubmed公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源。致病性CNV根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將CNVs分為3大類5級(jí)：①致病性CNVs (pathological copy number variations，pCNVs)；②良性CNVs；③臨床意義未明的CNVs；④可能致病性CNVs；⑤可能良性CNVs[15]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及率描述。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)受限胎兒的染色體異常檢出情況

134例胎兒生長(zhǎng)受限病例中總的染色體異常為13例(9.7%)，其中18-三體2例，13-三體1例，其他染色體異常1例，致病性基因拷貝數(shù)變異9例。其他染色體異常者是1例27歲孕婦，頸項(xiàng)透明層厚度(nuchal translucency, NT)增厚3.0 mm，絨毛穿刺CNV-seq無(wú)異常，25周表現(xiàn)為FGR、雙側(cè)腦積水、顱內(nèi)囊腫、雙側(cè)唇裂、內(nèi)臟轉(zhuǎn)位、右位心、雙腎回聲增強(qiáng)、左腎多囊、左足內(nèi)翻行核型檢查為46，XN，der(3)t(1;3)(p26)[3]/46,XN[46]。孕婦要求終止妊娠后引產(chǎn)。

將胎兒生長(zhǎng)受限病例分為孤立性胎兒生長(zhǎng)受限(胎兒只有生長(zhǎng)受限一項(xiàng)超聲異常)及綜合征性胎兒生長(zhǎng)受限(胎兒除生長(zhǎng)受限外尚有其他超聲軟指標(biāo)或結(jié)構(gòu)異常)，結(jié)果顯示孤立性生長(zhǎng)受限胎兒的染色體異常發(fā)病率為7.3%(3/41)，綜合征性生長(zhǎng)受限胎兒的染色體異常發(fā)病率為10.8%(10/93)，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.762)，詳見(jiàn)表1。

表1 不同類型FGR胎兒染色體異常檢出率Tab.1 Chromosome abnormities of fetus suffered from FGR

將生長(zhǎng)受限胎兒并其他超聲軟指標(biāo)及結(jié)構(gòu)異常匯總后發(fā)現(xiàn)，胎兒生長(zhǎng)受限最常見(jiàn)的伴發(fā)異常為心臟異常，兩者同時(shí)出現(xiàn)時(shí)染色體異常發(fā)病率為33.3%(7/21)，其次為消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常，其中，染色體異常發(fā)病率較高的是FGR伴發(fā)泌尿系統(tǒng)異常，染色體異常檢出率為31.3%(5/16)，不同伴發(fā)表現(xiàn)的生長(zhǎng)受限胎兒染色體異常檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.145)，詳見(jiàn)表2。

表2 不同伴發(fā)表現(xiàn)的FGR胎兒染色體異常檢出率Tab.2 Abnormal ultrasound combined with FGR

2.2 生長(zhǎng)受限胎兒的基因拷貝數(shù)變異檢出情況

134例標(biāo)本中共檢出致病性CNV 9例，均為新發(fā)突變(表3)。3例為孤立性FGR，6例為綜合征性FGR。9例患者中，4例為Wolf-Hirschhorn綜合征(Wolf-Hirschhorn syndrome, WHS)(病例1～4)，其余有3例為已知微缺失綜合征，包括1q21.1微缺失綜合征、16p12.1微缺失綜合征、8p23.1微缺失綜合征(病例5～7)，病例8缺失片段涉及3個(gè)功能基因，病例9涉及27個(gè)功能基因，評(píng)級(jí)均為致病性。

表3 FGR胎兒病理性基因拷貝數(shù)變異Tab.3 FGR with pathogenic CNVs

標(biāo)本中還檢出致病性未知病例3例。病例1，孕婦30歲，因孤立性FGR于33周行臍血穿刺，核型無(wú)異常，CNVs提示6q24.1(140960001-142020000)重復(fù)片段大小為1.06 Mb，為父源性。數(shù)據(jù)庫(kù)有3例該重復(fù)片段患者，臨床表現(xiàn)為整體發(fā)育遲緩；病例2，孕婦29歲，孕32周，胎兒偏小，心室強(qiáng)回聲，雙腎盂寬、持續(xù)右臍靜脈行臍血穿刺，顯示17p12(13220001-13620000)缺失，片段大小為0.4 Mb，數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到相關(guān)信息，為母源性；病例3，孕婦33歲，孕23周，F(xiàn)GR，行羊水穿刺，顯示2q22.1(137860001-138000000)缺失片段大小為0.14 Mb，數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到相關(guān)信息，孕婦無(wú)攜帶，父親拒絕檢測(cè)。

3 討論

以往研究[7，16-17]顯示，CNVs的檢測(cè)可以增加FGR胎兒4.8%～5.5%的染色體異常檢出率。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致，提示FGR胎兒病理性CNVs的檢出率高于核型，CNVs可增加3.7%的染色體異常檢出率，因此，在FGR的產(chǎn)前診斷中一定不能忽略CNVs的檢測(cè)。

本文研究還顯示，綜合征性FGR檢出率(10.8%)高于孤立性FGR(7.3%)，同以往研究一致，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示臨床工作中也需要重視孤立性FGR的染色體病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Shaffer等[18]應(yīng)用染色體微陣列(chromosomal microarray analysis, CMA)檢測(cè)251例FGR產(chǎn)前標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，孤立性FGR為2.7%，綜合征性FGR檢出率為10.3%。Borrell等[7]對(duì)133例FGR的研究顯示，孤立性及綜合征性FGR的病理性CNVs檢出率分別是10.0%及10.5%。Brun等[19]對(duì)143例FGR的胎兒進(jìn)行基因拷貝數(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，病理性CNVs的檢出率達(dá)7%，均為綜合征性FGR。吳堅(jiān)柱等[20]使用CMA分析了32例FGR樣本，發(fā)現(xiàn)孤立性FGR組、綜合征性FGR組的異常檢出率分別為14.3%和33.3%。馬玉紅等[21]的研究顯示，孤立性FGR組胎兒病理性CNVs檢出率為9.1%，綜合征性FGR組為22.7%。綜合以往研究結(jié)果，孤立性FGR檢出率為2.7%～14.3%，綜合征性FGR檢出率為10.3%～33.3%，檢出率差異較大，考慮與樣本量及病例選擇有關(guān)。

本研究顯示，孤立性FGR中的3例染色體異常均為病理性CNVs，Zhu等[22]的研究也有相似的發(fā)現(xiàn)，在孤立性FGR胎兒中，病理性CNVs的檢出率(33.3%)高于核型異常的檢出率(16.75%)，以上結(jié)果提示孤立性FGR更需要行CNVs的檢測(cè)。

An等[16]的研究顯示，以24周為界，將FGR分為早發(fā)型及晚發(fā)型，早發(fā)型(<24+0周) FGR的病理性CNVs檢出率為9.6%，與晚發(fā)型(24～33 周)的FGR(9.3%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中<24+0周孕婦42例，共檢出2例，檢出率4.8%，≥24周孕婦92例，共檢出11例，檢出率為12.0%，提示晚發(fā)型FGR的產(chǎn)前診斷也不容忽視。

目前己知的可以引起胎兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的微缺失微重復(fù)綜合征己超20多種，其中包括Williams-Beuren綜合征、WHS、22q綜合征等。以往研究[7]顯示，F(xiàn)GR胎兒中最常見(jiàn)的微缺失微重復(fù)綜合征為22q11.2重復(fù)綜合征、Xp22.3缺失綜合征及7q11.23缺失綜合征(Williams-Beuren 綜合征)，特別是在孤立性FGR胎兒中，這三類異常的總檢出率甚至超過(guò)核型異常。而本研究中，WHS檢出率最高，為4例，甚至超出非整倍體檢出率。Blanco等[23]對(duì)27例WHS患者研究分析，發(fā)現(xiàn)92%的WHS患兒在孕期存在胎兒生長(zhǎng)受限。Zhen等[24]的研究顯示，6例WHS胎兒中有5例出現(xiàn)FGR，最早在孕21周時(shí)出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩。WHS缺失區(qū)包含的WHSC1基因編碼位于核內(nèi)的具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，參與早期胚胎的發(fā)育，與出生前及出生后生長(zhǎng)發(fā)育遲緩相關(guān)。

本研究中還發(fā)現(xiàn)3例已知微缺失綜合征，包括1q21.1、16p12.1、8p23.1，以往的FGR研究[18]顯示，F(xiàn)GR所涉及的片段有4p16.3、7q11.2、12p13.3、19p13.3，分布在不同的染色體，且無(wú)明確的規(guī)律性，進(jìn)一步顯示了FGR不僅與染色體結(jié)構(gòu)異常或非整倍體有關(guān)，還涉及不同染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常。通過(guò)本研究可以看出，F(xiàn)GR是基因拷貝數(shù)變異相關(guān)度極高的疾病，隨著數(shù)據(jù)的積累，基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)也為新綜合征的發(fā)現(xiàn)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。