表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯抑制MAPK/NF-κB通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)

鄒 俊，杜逸亭

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院·成都市婦女兒童中心醫(yī)院 急診科，四川 成都 610073)

炎癥是宿主免疫反應(yīng)的重要適應(yīng)性機(jī)制，通常由細(xì)胞損傷和毒素引起[1]。過(guò)度和連續(xù)的炎癥可導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷，最終對(duì)宿主造成嚴(yán)重?fù)p害，如肝炎、肺炎、感染性休克和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[2]。正常的炎癥反應(yīng)是自限性的，通過(guò)促炎因子的下調(diào)和抗炎因子的上調(diào)來(lái)維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)[3]。因此，靶向失調(diào)的炎癥過(guò)程和調(diào)節(jié)炎癥因子是控制炎癥性疾病的有效治療方法。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是一種從茶葉中分離出來(lái)的兒茶素單體，具有抗炎的作用[4]。EGCG發(fā)揮其抗炎活性的主要方式之一是調(diào)節(jié)許多信號(hào)通路[5-6]，已有研究表明EGCG通過(guò)抑制cGAS/Sting/NLRP3通路來(lái)降低H2O2誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[7]。絲裂原活化蛋白激酶/核因子κB(MAPK/NF-κB)通路是參與炎癥反應(yīng)的重要通路之一[8]，已有研究顯示抑制MAPK/NF-κB通路可減輕脂多糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[9]。但EGCG能否通過(guò)調(diào)控MAPK/NF-κB通路來(lái)參與炎癥反應(yīng)尚不清楚。脂多糖(LPS)是一種內(nèi)毒素，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子及炎性介質(zhì)，利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞以構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，是評(píng)價(jià)藥物抗炎活性以及進(jìn)行機(jī)制研究的常用細(xì)胞模型之一[10-11]。因此，本研究利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞構(gòu)建體外細(xì)胞炎癥模型，觀察EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為EGCG在炎癥性疾病中的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 RAW 264.7細(xì)胞(貨號(hào)：CM-M056)購(gòu)自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器 EGCG(純度≥95%)、LPS購(gòu)自美國(guó)Sigm-Aldrich公司；地塞米松(DEX)購(gòu)自上海亞培生物科技有限公司；MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒均購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；iNOS、COX-2、p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、p38、IκBα、NF-κB、GAPDH兔多克隆抗體(anti-iNOS、anti-COX-2、anti-p-p38、anti-p-IκBα、anti-p-NF-κB、anti-p38、anti-IκBα、anti-NF-κB、anti-GAPDH)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自購(gòu)自上海潤(rùn)度生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，然后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中加濕培養(yǎng)。每隔1天換1次培養(yǎng)液，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，取傳代到第3代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，并接種于6孔板中，培養(yǎng)20 h后換含0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，然后參照文獻(xiàn)[12-14]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)不同濃度 EGCG 預(yù)處理對(duì) LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞形態(tài)、炎癥因子、iNOS 等釋放及MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響將細(xì)胞分為：對(duì)照組、LPS(1 μg/mL)組、LPS+EGCG-L(12.5 μmol/L)組、LPS+EGCG-M(25 μmol/L)組、LPS+EGCG-H(50 μmol/L)組、LPS+DEX(陽(yáng)性對(duì)照，0.5 μg/mL)組。根據(jù)MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin逆轉(zhuǎn)高劑量EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用將細(xì)胞分為L(zhǎng)PS+EGCG-H組、LPS+EGCG-H+Anisomycin(300 ng/mL)組，所有細(xì)胞在添加對(duì)應(yīng)的藥物處理1 h后，再加入100 μL 1 μg/mL LPS，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目 ①RAW264.7細(xì)胞形態(tài)觀察。收集各組細(xì)胞，利用倒置顯微鏡(型號(hào)：NIB900-FL，上海悌可光電科技有限公司)觀察各組細(xì)胞的形態(tài)特征。②MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)/100 μL 接種到96孔板中，其中調(diào)零組添加100 μL完全培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，向每孔中加入100 μL MTT溶液，37℃ 孵育4 h，除去上清，每孔中加入150 μL DMSO，于搖床上搖晃10 min后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)590 nm波長(zhǎng)處的吸光度。細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD調(diào)零組)/(OD對(duì)照組-OD調(diào)零組)×100%。③Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清中NO含量。收集各組細(xì)胞上清液50 μL于96孔板中，向上清中加入50 μL Griess A和50 μL Griess B試劑，室溫避光10 min。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm處的吸光度，NO含量由亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。④ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表達(dá)。嚴(yán)格按照TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒操作說(shuō)明操作步驟對(duì)各組細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。⑤Western Blot檢測(cè)iNOS、COX-2蛋白及MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。利用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白。將等量蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗iNOS、COX-2、p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、p38、IκBα、NF-κB、GAPDH在4℃下孵育過(guò)夜。次日，將膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。ImageJ軟件用于進(jìn)行灰度值分析。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度EGCG預(yù)處理對(duì)RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)特征的影響 對(duì)照組RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形；LPS組RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈梭形或伸出偽足等；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于正常，且隨著EGCG濃度的升高，RAW 264.7細(xì)胞呈圓形或橢圓形的狀態(tài)越明顯(見(jiàn)圖1)。

A：對(duì)照組；B：LPS組；C：LPS+EGCG-L組；D：LPS+EGCG-M組；E：LPS+EGCG-H組；F：LPS+DEX組。

2.2 不同濃度EGCG預(yù)處理對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響 經(jīng)不同處理的RAW 264.7細(xì)胞的存活率均大于92%，說(shuō)明12.5、25、50 μmol/L EGCG對(duì)RAW 264.7細(xì)胞無(wú)毒性作用(見(jiàn)表1)。

表1 EGCG對(duì)各組RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響

2.3 不同濃度EGCG預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NO含量的影響 與對(duì)照組比較，LPS組RAW 264.7細(xì)胞中NO含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細(xì)胞中NO含量顯著降低，且EGCG濃度越高，RAW 264.7細(xì)胞中NO含量越低(見(jiàn)表2)。

表2 EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NO含量的影響

2.4 不同濃度EGCG預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10水平的影響 與對(duì)照組比較，LPS組RAW 264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低，IL-10水平顯著升高(P<0.05)，且EGCG濃度越高，RAW 264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平越低，IL-10水平越高(見(jiàn)表3)。

表3 EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10水平的影響

2.5 不同濃度EGCG預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，LPS組RAW 264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且EGCG濃度越高，iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平越低(見(jiàn)圖2，表4)。

表4 各組RAW 264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)比較

A：對(duì)照組；B：LPS組；C：LPS+EGCG-L組；D：LPS+EGCG-M組；E：LPS+EGCG-H組；F：LPS+DEX組。

2.6 不同濃度EGCG預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，LPS組RAW 264.7細(xì)胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細(xì)胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且EGCG濃度越高，p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平越低。由于高濃度EGCG對(duì)MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用最顯著，因此，后續(xù)選用MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin來(lái)干預(yù)LPS+EGCG-H組，以驗(yàn)證Anisomycin能否逆轉(zhuǎn)高劑量EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用(見(jiàn)圖3，表5)。

A：對(duì)照組；B：LPS組；C：LPS+EGCG-L組；D：LPS+EGCG-M組；E：LPS+EGCG-H組；F：LPS+DEX組。

表5 各組RAW 264.7細(xì)胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達(dá)比較

2.7 MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin逆轉(zhuǎn)高劑量EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用 與LPS+EGCG-H組比較，LPS+EGCG-H+Anisomycin組RAW 264.7細(xì)胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、COX-2、iNOS蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞上清中NO含量、TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.05)，RAW 264.7細(xì)胞有少量呈梭形、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變(見(jiàn)圖4、5、表6、7)。

A：LPS+EGCG-H組；B：LPS+EGCG-H+Anisomycin組。

圖5 倒置顯微鏡觀察RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)

表6 RAW 264.7細(xì)胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、COX-2、iNOS蛋白表達(dá)比較

表7 RAW 264.7細(xì)胞中NO含量及細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比較

3 討論

炎癥具有腫脹、發(fā)紅、發(fā)熱和經(jīng)常疼痛的典型特征，是對(duì)損傷、組織缺血、自身免疫反應(yīng)或感染因子的關(guān)鍵防御反應(yīng)，也是自身免疫性疾病機(jī)體損傷的主要促成因素[15]。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系是白血病小鼠體內(nèi)的一種單核巨噬細(xì)胞，LPS刺激的巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)大量炎癥介質(zhì)(NO)和炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10)以及iNOS、COX-2的產(chǎn)生[16]。TNF-α和IL-1β是由巨噬細(xì)胞分泌，可加重炎癥反應(yīng)的因子，IL-6為主要的促炎細(xì)胞因子，IL-10具有多種免疫功能，可以抑制炎癥和細(xì)胞免疫反應(yīng)，它們?cè)谘装Y反應(yīng)的調(diào)控中起著重要的作用[17]。COX-2作為一種誘導(dǎo)酶，可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)NO和iNOS的合成與釋放，加重機(jī)體炎癥[18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS處理的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)呈梭形，細(xì)胞中NO含量及iNOS、COX-2蛋白顯著升高，細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)顯著升高，IL-10表達(dá)顯著降低，提示LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞體外炎癥模型構(gòu)建成功。

EGCG是綠茶多酚的主要成分，其具有重要的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抗血栓形成、抗血管生成、抗炎和抗腫瘤作用[19]。近年來(lái)，關(guān)于EGCG在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用的研究越來(lái)越多。Wang等[20]報(bào)道EGCG通過(guò)其抗炎作用對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠起保護(hù)作用；王友元等[21]表明EGCG通過(guò)TLR4調(diào)節(jié)的NF-κB途徑對(duì)炎癥細(xì)胞因子進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎具有緩解作用；趙悅伶等[22]發(fā)現(xiàn)EGCG能夠抑制炎癥因子分泌，減少由腸道炎癥引起的小鼠全身性炎癥反應(yīng)，對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病起到一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，EGCG可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)，提示EGCG可抑制炎癥反應(yīng)，這與上述的研究結(jié)果是一致的。表明EGCG是一種可產(chǎn)生抗炎作用的藥物，對(duì)于炎癥性疾病的治療具有廣闊的應(yīng)用前景。然而本研究只是在體外細(xì)胞水平上證明了EGCG的抗炎作用，而關(guān)于EGCG在體內(nèi)能否產(chǎn)生同等效應(yīng)尚需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

MAPK/NF-κB信號(hào)通路參與控制各種促炎基因的激活，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子以及重要的炎癥蛋白如COX-2和iNOS的產(chǎn)生，進(jìn)而加重炎癥性疾病[23]。據(jù)報(bào)道，橄欖油多酚通過(guò)抑制MAPK/NF-κB通路減輕氧甾醇誘導(dǎo)的腸細(xì)胞的促炎反應(yīng)[24]；BML-111通過(guò)抑制p38 MAPK/NF-κB通路活化促進(jìn)腸缺血再灌注早期肺損傷炎癥消退[25]。而EGCG能否調(diào)控MAPK/NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，EGCG可以下調(diào)MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-p38、p-IκBα、p-NF-κB的表達(dá)，且呈濃度依賴效應(yīng)，提示EGCG可能通過(guò)抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用。為了驗(yàn)證EGCG的調(diào)控機(jī)制，本研究利用MAPK/NF-κB信號(hào)通路激活劑Anisomycin進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Anisomycin可以逆轉(zhuǎn)EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的抗炎作用，證實(shí)了EGCG是通過(guò)抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用。本研究以MAPK/NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討了EGCG的抗炎機(jī)制，證實(shí)了EGCG通過(guò)抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，為EGCG能夠應(yīng)用于臨床治療炎癥性疾病奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，EGCG可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)，該機(jī)制與抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。然而，EGCG調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)涉及的通路較多，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。