石蒜屬種間雜交種的鑒定和分子身份證構(gòu)建

王 黎，周 琪，高燕會

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

石蒜屬Lycoris植物隸屬百合目Liliflorae石蒜科Amaryllidaceae，具地下鱗莖，為多年生草本植物；全球約有20多種，中國有15種，主要分布在江蘇、浙江和安徽等地[1]。石蒜屬植物花型花色變異豐富，種間雜交親和性高，對石蒜屬植物進(jìn)行遺傳育種改良，極有希望選育出有中國特色的切花新品種[2]，市場前景和園林應(yīng)用前景極為廣闊。同時，石蒜鱗莖富含生物堿、黃酮及多糖等化學(xué)成分，藥用價值較高[3-4]。目前，石蒜屬植物新品種選育主要通過種間和種內(nèi)雜交、自然群體選擇，對其雜交種真實(shí)性的鑒定主要根據(jù)開花時花色和花型等農(nóng)藝性狀的變化來判斷；但由于石蒜屬植物生長周期長，種子播種后5～6 a才開花，早期鑒定及分類較為困難，從而影響銷售和生產(chǎn)。

常用的雜種鑒定方法有形態(tài)標(biāo)記法、生化標(biāo)記法和DNA標(biāo)記法等。形態(tài)標(biāo)記耗時費(fèi)力，易受環(huán)境條件和檢測人員主觀判斷的影響；生化標(biāo)記數(shù)目少且穩(wěn)定性差，不能進(jìn)行多年生植物雜交種的早期鑒定，無法滿足生產(chǎn)和市場的需求；相比之下，DNA標(biāo)記簡單序列重復(fù)(SSR)、目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)、內(nèi)部簡單序列重復(fù)(ISSR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)和熒光標(biāo)記SSR能反映生物個體或種群間某些特異性DNA片段，不受生物自身生長階段和環(huán)境條件的影響，標(biāo)記數(shù)量較多，重復(fù)性好，開發(fā)成本低，不影響性狀表達(dá)[5-7]，已在冬瓜Benincasa hispida[8]、甜菜Beta vulgaris[9]、姜黃屬 Curcum植物[10]、枇杷Eriobotrya japonica[11]等種質(zhì)資源遺傳多樣性、雜交種鑒定、品種鑒定和分子身份證的構(gòu)建等方面得到廣泛應(yīng)用。其中SSR標(biāo)記是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)、較成熟的遺傳標(biāo)記，但由于工作量大、精度低、分析量小，無法完成大批量樣品的檢測，而熒光標(biāo)記SSR能準(zhǔn)確獲得目標(biāo)DNA片段的大小(精確至1 bp)，檢測結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確且高效適用于大批量品種的檢測分析，已被應(yīng)用于落花生Arachis hypogaea[12]、高山杜鵑 Rhododendron lapponicum[13]、百合屬 Lilium[14]、芒 Miscanthus sinensis[15]等 F1代雜交種真實(shí)性和純度檢測、遺傳多樣性分析、核心種質(zhì)的構(gòu)建等。石艷等[16]開發(fā)了石蒜屬植物換錦花L. sprengeri的表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)標(biāo)記，用于鑒定換錦花-中國石蒜L. chinensis雜交種，為石蒜屬種間雜交種F1的鑒定提供了借鑒。為進(jìn)一步完善石蒜屬植物種間雜交種F1的鑒定技術(shù)，本研究篩選了15對EST-SSR引物，通過EST-SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建親本換錦花、石蒜L. radiata、中國石蒜以及石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種等78個樣品的分子身份證，并進(jìn)行雜交種真實(shí)性鑒定，為石蒜屬植物的親緣關(guān)系分析、品種選育、雜交種早期鑒定及資源保護(hù)和利用等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

石蒜、中國石蒜、換錦花及石蒜-中國石蒜、石蒜-換錦花雜交種F1共78個樣品，均栽植于浙江農(nóng)林大學(xué)石蒜屬種質(zhì)資源圃，于2020年8—9月盛花期采集各材料花瓣。

1.2 基因組 DNA 提取和 EST-SSR 引物篩選

采用改良CTAB法提取供試材料花瓣基因組DNA，用Nanodrop 2000測定DNA的質(zhì)量和濃度，經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

分別以親本(中國石蒜、石蒜和換錦花)基因組DNA為模板，從59對石蒜屬植物通用EST-SSR引物中篩選條帶清晰、重復(fù)性好且具多態(tài)性的引物進(jìn)行擴(kuò)增[16]。EST-SSR PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(10.0 μL)為：Taq DNA 聚合酶 1.0×16.67 nkat，氯化鎂 (MgCl2) 1.0 mmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，引物 0.8 μmol·L-1，DNA 40 ng。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性 30 S，退火溫度 30 S，72 ℃ 延伸 30 S，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃保溫30 min。用質(zhì)量濃度10.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染顯色檢測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，顯色后記錄觀察拍照。

1.3 熒光標(biāo)記EST-SSR毛細(xì)管電泳和雜交種鑒定

從59對多態(tài)性引物中篩選到15對具多態(tài)性的EST-SSR引物(表1)，在正向引物中分別加注FAM(藍(lán))、HEX (綠)、TAMRA (黃)和 ROX (紅)熒光，對78個樣品進(jìn)行多重 PCR 擴(kuò)增。利用遺傳分析儀(ABI 3730XL，ThermoFisher Scientific，美國)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測分析。根據(jù)電泳結(jié)果，選擇在親本(中國石蒜、石蒜和換錦花)種內(nèi)一致、種間具多態(tài)性、特異、單一且重復(fù)性好的引物用于雜交種鑒定。比較親本與雜交種F1的 EST-SSR PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交種F1具有父母本互補(bǔ)型或有變異型擴(kuò)增帶型的樣品鑒定為真實(shí)雜種。計(jì)算雜交種鑒定率=真實(shí)雜交種樣本數(shù)/樣本總數(shù)×100%。

表1 15對 EST-SSR 引物序列和 PCR 產(chǎn)物Table 1 Sequences and PCR products of 15 pair of SSR primers

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與分子身份證構(gòu)建

利用Gene mapper 4.1軟件整理分析EST-SSR熒光標(biāo)記的毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)，根據(jù)每個引物對每個樣品擴(kuò)增后有無峰，轉(zhuǎn)化成0/1格式的二元矩陣，無信號或數(shù)據(jù)缺失賦值“2”。利用POPgene 1.32計(jì)算觀測等位基因數(shù)(Na)，有效等位基因數(shù)(Ne)，Nei’s基因遺傳多樣性指數(shù)(H)，Shannon’s指數(shù)(In)和多態(tài)性信息量(PIC)。使用NTsys2.10e計(jì)算石蒜屬親本及雜交種的Nei’s 遺傳距離和SM遺傳相似系數(shù)，并用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

參照徐雷峰等[14]方法將獲得的熒光標(biāo)記EST-SSR多態(tài)性數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字(1～9)表示，當(dāng)基因型數(shù)大于9時，用小寫字母(a、b、c、 ···)依次表示，無帶用0表示。按照引物擴(kuò)增帶型數(shù)由少到多的順序，記錄各樣品在15對引物上的擴(kuò)增帶型數(shù)據(jù)，通過個位數(shù)字或小寫字母編碼構(gòu)建各雜交種的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本特異型 EST-SSR 引物的篩選

熒光毛細(xì)管電泳檢測發(fā)現(xiàn)：15對引物在25個樣品中均能獲得大小精確的DNA片段，篩選其中具有種內(nèi)一致性且種間多態(tài)性的4對引物。由表2可知：SSR203和SSR15在3個親本中均能得到特征條帶，SSR32可在石蒜和中國石蒜中得到特征條帶，SSR198可在石蒜和換錦花中得到特征條帶。因此SSR203、SSR115和SSR198用來鑒定石蒜-換錦花雜交種(包括正交和反交)的真實(shí)性，SSR203、SSR115和SSR32可鑒定石蒜-中國石蒜雜交種的真實(shí)性。

表2 4個熒光標(biāo)記 EST-SSR 引物在石蒜屬親本上的特征條帶Table 2 Characteristic bands of 4 fluorescent labeled EST-SSR primers on the parents of Lycoris

2.2 雜交種 F1 代的鑒定

利用SSR203、SSR115和SSR198對27個石蒜-換錦花雜交種F1代進(jìn)行鑒定。由表3可知：SSR203從石蒜-換錦花雜交F1后代群體中鑒定到88.46%的真實(shí)雜交種，其中具有雙親特征條帶(189/204 bp)的占69.23%，出現(xiàn)特異條帶的有19.23%；SSR115從石蒜-換錦花雜交種F1群體中鑒定到84.61%的真實(shí)雜交種，其中具有雙親特征條帶的占53.85%，出現(xiàn)特異條帶的占30.77%；SSR198只鑒定到53.85%的真實(shí)雜交種。分別利用SSR203+SSR115、SSR203+SSR115+SSR198進(jìn)行多重PCR，從石蒜-換錦花正反交F1雜交群體中均鑒定到96.30%的真實(shí)雜交種，大于SSR203+SSR198 (88.89%)和SSR115+SSR198(88.89%)組合的鑒定結(jié)果。因此采用SSR203+SSR115和SSR203+SSR115+SSR198可以早期鑒定石蒜-換錦花雜交種F1的真實(shí)性。

表3 EST-SSR 引物對石蒜屬種間雜交種鑒定Table 3 Identification of interspecific hybridization of Lycoris by EST-SSR primers

同樣，利用引物SSR203、SSR115和SSR32對石蒜-中國石蒜雜交種F1進(jìn)行鑒定。SSR203鑒定石蒜-中國石蒜雜交種F1的真實(shí)雜交種占80.77%，其中具有雙親特征條帶(175/169 bp)的占42.31%，具變異條帶的有38.46%；SSR115和SSR32鑒定石蒜-中國石蒜雜交種F1群體的真實(shí)性分別為50.00%和69.23%。采用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SR203+SSR115+SSR32多重PCR擴(kuò)增，石蒜-中國石蒜雜交種F1群體的真實(shí)雜交種鑒定效率均達(dá)96.15%，高于SSR115+SSR32鑒定效率(76.92%)。因此可用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SSR203+SSR115+SSR32對石蒜和中國石蒜雜交種真實(shí)性進(jìn)行鑒定。

為節(jié)省成本，縮短育種周期和減少工作量，本研究采用SSR203+SSR115對石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種F1代進(jìn)行早期鑒定。

2.3 雜交種遺傳多樣性分析

2.3.1 引物多態(tài)性分析 篩選出的15對熒光標(biāo)記EST-SSR引物在78個樣品中擴(kuò)增效果較好(表4)，共得到擴(kuò)增條帶92條，擴(kuò)增條帶最多的是SSR32 (10條)，最少的是SSR21 (2條)，平均6.13條。多態(tài)性信息量 (PIC)為 0.692 3～1.000 0，其中 SSR253 最小 (0.692 3)，SSR20 和 SSR142 最高 (1.000 0)，平均為0.913 7。所有PIC值均大于0.500 0，說明均為高多態(tài)性引物，可反映雜交種間遺傳差異和遺傳多樣性。

2.3.2 石蒜屬種間雜交種的遺傳多樣性分析 以15對熒光標(biāo)記EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算遺傳相似系數(shù)并進(jìn)行UPGMA聚類分析。由圖1可知：各樣品遺傳相似系數(shù)為0.76～0.98，在相似系數(shù)為0.77處25個親本和53個雜交種聚為Ⅰ和Ⅱ兩大類，Ⅰ類主要為換錦花、石蒜-換錦花雜交種，但包含了58、60、61、64和66等石蒜-中國石蒜雜交種，且與石蒜-換錦花雜交種聚在一起，推測5個雜交種的母本可能是石蒜。Ⅱ類包括Ⅱa(石蒜)、Ⅱc(中國石蒜)、Ⅱb(中國石蒜-石蒜雜交種)等3個亞類，說明本研究所用的15對熒光標(biāo)記EST-SSR可用作石蒜、中國石蒜、換錦花及種間雜交種的早期鑒定。

圖1 基于熒光標(biāo)記EST-SSR的石蒜屬親本和雜交種的聚類圖Figure 1 Cluster diagram of Lycoris parents and hybrids based on EST-SSR

2.4 種間雜交種 F1 的分子身份證編碼

由表5可知：15對熒光標(biāo)記EST-SSR引物擴(kuò)增各樣品，共得到153種帶型，平均每條擴(kuò)增10.2帶型，其中SSR221擴(kuò)增帶型最少(2種)，SSR32擴(kuò)增帶型最多(30種)。根據(jù)表4對15對熒光標(biāo)記ESTSSR引物擴(kuò)增得到的基因型或帶型賦值并排序，以此對各樣品的擴(kuò)增情況編碼分子身份證，擴(kuò)增條帶位置相同則編碼符號相同，說明基因型相同。由表6可知：各親本和各雜交種均具有唯一的分子身份證，15對熒光標(biāo)記EST-SSR引物可有效鑒別石蒜屬親本和種間雜交種。

表4 EST-SSR引物擴(kuò)增條帶的等位基因數(shù)和多態(tài)性信息量Table 4 Number of alleles and polymorphism information of 15 EST-SSR primers

表5 15 對熒光標(biāo)記EST-SSR引物在親本及雜交種F1上的擴(kuò)增帶型Table 5 Amplification patterns of 15 pairs of fluorescent labeled EST-SSR primers on parents and hybrid F1

表6 石蒜、中國石蒜、換錦花及種間雜交種分子身份證代碼Table 6 Molecular ID codes of parent L. radiata， L. chinensis， L. sprengeri and interspecific hybrids

3 結(jié)論與討論

SSR熒光標(biāo)記在毛白楊Populus tomentosa[17]和建蘭Cymbidium ensifolium[18]等核心種質(zhì)構(gòu)建、落花生[12]和山茶屬Camellia植物[19]等分子身份證構(gòu)建以及三葉青Tetrastigma hemsleyanum[20]、雜交蘭[21]等種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中得到驗(yàn)證。本研究表明：利用熒光標(biāo)記EST-SSR檢測石蒜屬各親本及雜交種的真實(shí)性、分析其間遺傳關(guān)系，精準(zhǔn)高效，結(jié)果可靠。

本研究利用15對熒光標(biāo)記EST-SSR引物從石蒜、中國石蒜、換錦花和種間雜交種共78個樣品中擴(kuò)增到92個條帶，平均每對引物6.13條；15對ESR-SSR引物多態(tài)性信息量均大于0.500 0，平均為0.913 7，較好地反映了雜交種間的遺傳差異和遺傳多樣性，與茶Camellia sinensis[22]、百合[14，23]等的研究結(jié)果類似。利用熒光標(biāo)記EST-SSR引物鑒定石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種F1代，發(fā)現(xiàn)SSR203+SSR115等引物對雜交種鑒定的真實(shí)性分別達(dá)96.30%和96.15%，與SSR203+SSR115+SSR198和SSR203+SSR115+SSR32等引物鑒定結(jié)果相同，因此用SSR203+SSR115引物對石蒜-換錦花、石蒜-中國石蒜雜交種F1進(jìn)行鑒定，可大大縮短育種周期，減少工作量并節(jié)約成本。

分子身份證構(gòu)建以 DNA 指紋圖譜為基礎(chǔ)，是識別種質(zhì)資源的標(biāo)志，可以更加簡單明了地識別和檢索種質(zhì)資源[24]。本研究利用15對熒光標(biāo)記EST-SSR引物共擴(kuò)增出92個條多態(tài)性條帶，153種帶型，按照統(tǒng)計(jì)方便、書寫簡潔、字符串長短適中、易于檢索及充分利用引物的原則，采用基因型賦值編碼法[14]對石蒜屬親本和雜交種單一位點(diǎn)帶型或雜合帶型進(jìn)行編碼，構(gòu)建石蒜屬植物親本和雜交種的分子身份證，較好地區(qū)分了78份石蒜屬植物材料，說明該方法適用于石蒜屬植物的鑒定。

以RAPD、ISSR和SCoT等分子標(biāo)記技術(shù)分析石蒜屬植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性，建立遺傳距離和遺傳相似系數(shù)矩陣，構(gòu)建相應(yīng)分子樹狀圖和指紋圖譜[2，25-26]，其目的主要是為了雜交種的親本配制、野生資源的高效利用等。本研究利用15對熒光標(biāo)記EST-SSR引物擴(kuò)增了78個石蒜屬植物的遺傳物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)各樣本遺傳相似系數(shù)為0.76～0.98；UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)：相似系數(shù)為0.77時，25個親本和53個雜交種聚為兩大類，Ⅰ類包括親本換錦花、石蒜-換錦花的雜交種，Ⅱ類又分為Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc 等3個亞類，包括石蒜、中國石蒜-石蒜雜交種和中國石蒜，說明15對熒光標(biāo)記EST-SSR可將石蒜、中國石蒜、換錦花及種間雜交種有效聚類，結(jié)合雜交種的遺傳多樣性認(rèn)為：熒光標(biāo)記EST-SSR可有效鑒定石蒜屬雜交種F1，并厘清其間的遺傳關(guān)系。