前列腺相關疾病譜系中Glypican-1的表達及臨床意義

徐海霞，林香桃，周 歡，談 順

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是泌尿男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。隨著中國人口老齡化的增加，我國PCa的發(fā)病率也呈逐年增高趨勢[1]。直腸指檢和血液中前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)檢測是PCa的主要檢測方法。然而，血清PSA診斷PCa的特異性僅33%[2-3]，導致大量假陽性病例增加，尋找新的PCa生物學標志物具有重要意義。磷脂酰肌醇聚糖-1(Glypican-1)屬于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)家族，核心蛋白的相對分子質(zhì)量為(6.0～7.0)×104。Glypican-1可檢測到兩種形式：膜結合在細胞表面的形式[(5.5～6.0)×104]和5.2×104、4.0×104的可溶性分泌形式。有研究在檢測前列腺疾病中蛋白聚糖的表達時發(fā)現(xiàn)Glypican-1的可溶性形式[4]。本文旨在探討可溶性Glypican-1是否可以用于PCa的診斷，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年9月～2020年5月?？谑腥嗣襻t(yī)院病理科存檔的PCa根治術和經(jīng)尿道前列腺電切術的石蠟標本及血清學標本。其中PCa 60例，前列腺上皮內(nèi)瘤(prostatic intraepithelial neoplasia, PIN)60例[高級別前列腺上皮內(nèi)瘤(high-grade prostatic intraepithelial neoplasia, HGPIN)20例，低級別前列腺上皮內(nèi)瘤(low-grade prostatic intraepithelial neoplasia, LGPIN)40例]，前列腺增生(prostatic hyperplasia, BPH)40例。60例PCa患者中，33例PSA值<20 ng/mL，19例20～100 ng/mL，8例>100 ng/mL；60例PIN患者中，36例PSA值<20 ng/mL，21例20～100 ng/mL，3例>100 ng/mL；40例BPH患者中，34例PSA值<20 ng/mL，6例20～100 ng/mL。收集相應患者的血清，用EP管分裝置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2 試劑標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4～5 μm厚連續(xù)切片，分別行HE及免疫組化染色。Anti-Glypicam 1(ab226855)購自Abcam公司，免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司。血清學Glypican-1和ELISA試劑盒(BlueGene Biotech, E01G0226, 96T)均購自Abcam公司。

1.3 方法免疫組化染色采用MaxVision法，以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性標本作為陽性對照。ELISA法檢測Glypican-1的含量。以上實驗步驟嚴格按試劑盒說明書操作。結果判定：以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用染色強度結合陽性細胞百分比分別進行半定量評分[5]：(1)按細胞染色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。(2)按陽性細胞百分比計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將兩項得分結果相乘作為最終得分：0～1分為(-)，2～4為(+)，6～8為()，9～12為()。(-～+)為陰性組，(～)為陽性組。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，等級資料用非參數(shù)檢驗比較Glypican-1蛋白在不同組別中的差異。用Spearman秩相關檢驗分析血清學Glypican-1和PSA的相關性，繪制血清學Glypican-1和PSA診斷PCa的ROC曲線，并確定診斷界值；曲線下面積小于0.7表示診斷準確度較低，在0.7～0.9之間表示診斷準確度中等，0.9以上表示診斷準確度較高。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 前列腺組織中Glypican-1的表達BPH：鏡下見腺體和間質(zhì)不同比例增生，導管和腺泡大小不一，基底細胞存在(圖1A)，分泌上皮Glypican-1(-)(圖1B)；LGPIN：鏡下見腺泡分泌上皮異型增生，擠集成多層，核增大，可見小核仁，基底細胞存在(圖2A)，分泌上皮Glypican-1(+)(圖2B)；HGPIN：鏡下見腺泡細胞核異型明顯，染色質(zhì)濃染，核仁顯著增大，腔內(nèi)橋接乳頭或篩狀結構形成，基底細胞存在(圖3A)，分泌上皮Glypican-1()(圖3B)；PCa：鏡下見腺體密集或疏松排列，核增大不規(guī)則，核仁明顯，基底細胞消失，腔內(nèi)見類晶體(圖4A)，腫瘤細胞Glypican-1()(圖4B)。免疫組化檢測顯示，160例前列腺標本中Glypican-1表達定位于分泌上皮細胞胞質(zhì)，在正常前列腺上皮和間質(zhì)中均陰性。PCa組Glypican-1陽性44例，陽性率為73.4%(44/60)；HGPIN組陽性8例，陽性率為40%(8/20)；LGPIN組陽性3例，陽性率為7.5%(3/40)；BPH組陽性2例，陽性率為5%(2/40)。Glypican-1在BPH、LGPIN、HGPIN及PCa中的表達水平依次升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1)。

圖1 A.前列腺增生腺體和間質(zhì)不同比例增生，導管和腺泡大小不一，基底細胞存在；B.前列腺增生中Glypican-1(-)，MaxVision法 圖2 A.低級別前列腺上皮內(nèi)瘤腺泡分泌上皮異型增生，擠集成多層，核增大，可見小核仁；B.低級別前列腺上皮內(nèi)瘤中Glypican-1(+)，MaxVision法 圖3 A.高級別前列腺上皮內(nèi)瘤乳頭或篩狀結構形成，腺泡細胞核異型明顯，染色質(zhì)濃染，核仁顯著增大；B.高級別前列腺上皮內(nèi)瘤中Glypican-1()，MaxVision法 圖4 A.前列腺癌腺體密集或疏松排列，核增大不規(guī)則，核仁明顯，基底細胞消失，腔內(nèi)見類晶體；B.前列腺癌中Glypican-1()，MaxVision法

表1 PCa、HGPIN、LGPIN及BPH中Glypican-1的表達[n(%)]

2.2 血清學標本中Glypican-1的表達本組160例血清學樣本中PCa組60例、PIN組60例及BPH組40例。Glypican-1相對含量：BPH組中位數(shù)為0.805，四分位數(shù)間距為0.464；PIN組中位數(shù)為0.805，四分位數(shù)間距為0.43；PCa組中位數(shù)為1.041，四分位數(shù)間距為0.376。Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，PCa組Glypican-1表達水平明顯高于PIN組和BPH組(P<0.001)。Spearman秩相關檢驗結果顯示，血清學Glypican-1和PSA表達呈正相關(r=0.32，P<0.001，表2)。ROC曲線繪制血清學Glypican-1和PSA的檢測結果，Glypican-1確定診斷界值為0.854，即Glypican-1結果≥0.854時，診斷PCa的敏感度為88.3%，特異度為55.0%，曲線下面積為0.749(95%CI：0.676～0.823，P<0.05)；血清學PSA診斷界值定為5.41時，診斷PCa特異度為34%，血清Glypican-1的特異度(55%)明顯優(yōu)于血清PSA(34%)(圖5)。

表2 PCa組、PIN組、BPH組中血清學Glypican-1和PSA的差異

圖5 A.血清學Glypican-1的ROC曲線；B.血清學PSA的ROC曲線

3 討論

PCa好發(fā)于老年男性[6]。目前PCa的治療方案包括主動監(jiān)測、前列腺切除術、雄激素剝奪治療、化療及放療或者聯(lián)合治療等[7]。治療途徑雖然多樣，但多數(shù)患者最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性PCa，直至PCa晚期，中位生存期小于3年[8]。Glypican-1是一種硫酸肝素蛋白聚糖，由一個核心蛋白和幾個肝素連接而成硫酸鹽鏈，并通過GPI錨定連接到細胞上表面，在腫瘤細胞生長中起關鍵作用。越來越多的研究表明Glypican-1作為一種生長因子輔助受體，其在多種實體腫瘤中過表達，包括胰腺癌[9-10]、乳腺癌[11]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[12-13]和PCa患者尿液、血液中均可檢測到Glypican-1[14-15]。本組免疫組化檢測結果顯示，Glypican-1在BPH、LGPIN、HGPIN及PCa中的表達水平依次升高，且在PCa中的表達最高，平均秩次117.20，BPH、LGPIN、HGPIN中的平均秩次分別為46.10、55.23、89.75。Glypican-1在HGPIN中的表達明顯高于LGPIN和BPH，LGPIN和BPH中表達差異無統(tǒng)計學意義。分析其原因在于篩選出的20例HGPIN病例14例伴發(fā)PCa，提示HGPIN與PCa顯著相關。本實驗發(fā)現(xiàn)PCa中Glypican-1在癌細胞和間質(zhì)細胞中均有表達，并且癌細胞中的表達強于間質(zhì)細胞，這種改變與Suhovskih等[16]的研究有相同之處。在前列腺腫瘤中，由于不同的蛋白聚糖表達組合及其不同的表達水平導致了蛋白聚糖呈高度個體化的表達模式，PCa細胞中Glypican-1旁分泌激活的增加及其定位的改變，是否提示或反映侵襲性PCa的表型，結論仍需深入探究。

血清學PSA檢測PCa的敏感度高但低特異性，導致許多患者行不必要的前列腺活檢，臨床急需尋找其他血清學腫瘤標志物以便更好地區(qū)分PCa的存在與否。Glypican-1被報道有望作為新的聚糖生物標志物以改善PCa的檢測[17]。本實驗通過檢測血清學Glypican-1的濃度發(fā)現(xiàn)Glypican-1相對含量在PCa組明顯高于PIN組和BPH組，結合組織學檢查結果將血清學Glypican-1和PSA檢測結果繪制ROC曲線，血清學Glypican-1檢測方法的敏感度為88.3%，特異度為55.0%，與PSA對比分析發(fā)現(xiàn)，PSA增高的病例Glypican-1亦明顯增高，但是血清學Glypican-1的特異度(55.0%)明顯優(yōu)于血清PSA的特異度(34%)，且血清學中Glypican-1的表達和組織學中Glypican-1的表達一致，其表達譜系為BPH、LGPIN、HGPIN及PCa中Glypican-1表達水平依次升高。血清學Glypican-1顯示了優(yōu)于臨床血清PSA檢測PCa的標準，因此與單獨使用PSA相比，Glypican-1與PSA聯(lián)合標記PCa的整體特異性高于單獨檢測，聯(lián)合檢測可提高PCa檢測的特異性，減少不必要的穿刺活檢次數(shù)。本組結果證明Glypican-1具有作為PCa生物標志物的潛力。

本實驗探討Glypican-1在前列腺相關連續(xù)疾病中的表達譜系：Glypican-1在BPH、PIN和PCa中的表達呈遞進關系。Glypican-1有望作為PCa的腫瘤標志物，為PCa的早期診斷和未來靶向治療提供理論依據(jù)。