結(jié)直腸癌離心性表達(dá)Cdc42伴E-cadherin缺失的預(yù)后分析

羅金風(fēng)，劉廣龍，徐東艷，李小清，鄧永鍵

細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)是小GTP酶Rho家族成員，在響應(yīng)不同信號時(shí)可以從無活性GDP結(jié)合形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訥TP結(jié)合形式[1]，參與維持細(xì)胞骨架、細(xì)胞極性、分子運(yùn)輸?shù)萚2-4]。Cdc42在多種腫瘤中過度激活，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cdc42在結(jié)直腸癌中存在表達(dá)分布的差異，有表達(dá)朝向腺管中心的向心性表達(dá)和表達(dá)背離腺管中心的離心性表達(dá)，且其離心性表達(dá)與細(xì)胞侵襲性偽足形成有關(guān)[5]，但具體機(jī)制尚不清楚。E-cadherin分子參與維持細(xì)胞極性[6]，與腫瘤轉(zhuǎn)移行為有關(guān)[7]。那么Cdc42離心性表達(dá)是否與E-cadherin分子之間存在關(guān)系呢？本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測Cdc42和E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)分布情況，并分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測兩者的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2007年1月～2008年12月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科存檔的結(jié)直腸癌標(biāo)本198例，均具有完整的隨訪資料，其中男性106例，女性92例；年齡≤60歲80例，>60歲118例；浸潤深度達(dá)固有肌層33例，達(dá)漿膜下層133例，突破漿膜層32例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移130例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移180例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移18例。標(biāo)本均經(jīng)兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師明確診斷，且所有患者術(shù)前均未接受放、化療。

1.1.2細(xì)胞 結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、LS174t、SW480、Caco2、SW620、LoVo，均購自ATCC庫。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法，將組織蠟塊制作成組織芯片，3 μm厚連續(xù)切片，烤干備用。常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽進(jìn)行高壓熱修復(fù)，3%H2O2封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，PBS返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。用PBS代替一抗作為陰性對照。兔多克隆抗體Cdc42(ab187643，稀釋比1 ∶200)購自美國Abcam公司，即用型E-cadherin(ZM-0092)抗體、通用型試劑盒(PV 6000)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9017)，均購自北京中杉金橋公司。

1.2.2免疫熒光 組織切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，滴加一抗孵育過夜，滴加熒光二抗孵育，DAPI(Biosharp)染核，甘油封固。Alexa Fluor 488標(biāo)記抗兔IgG(購自北京中杉金橋公司)。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 所有結(jié)直腸癌細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640，置于37 ℃ 5%CO2孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，消化鋪板，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染Control和Cdc42質(zhì)粒，48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率并開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測濃度和純度均合格，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11701)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，引物序列詳見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.5Western blot法 待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，鋪板轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入Loading Buffer變性，-20 ℃保存。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒(PG112)配制10%凝膠，恒壓120 V、90 min電泳，恒流200 mA、90 min轉(zhuǎn)模，5%牛奶室溫封閉1 h，一抗Cdc42和E-cadherin 4 ℃搖床孵育過夜，室溫孵育二抗45 min，顯影并用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)Cdc42陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)朝向腺管中心，位于腺體頂端為向心性表達(dá)，表達(dá)背離腺管中心，位于腺體基底部為離心性表達(dá)。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，只要觀察到一個(gè)細(xì)胞存在離心性表達(dá)，即將此病例判讀為離心性表達(dá)，否則為向心性表達(dá)。Cdc42離心性表達(dá)的病例，做連續(xù)切片，檢測同一位置的E-cadherin表達(dá)，E-cadherin表達(dá)定位于細(xì)胞膜，陰性判讀為E-cadherin表達(dá)缺失。與離心性表達(dá)相比，向心性表達(dá)的患者預(yù)后較好，因不是本實(shí)驗(yàn)的主要研究對象，故在此不進(jìn)行E-cadherin表達(dá)情況的分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2檢驗(yàn)分析各組間表達(dá)的差異性；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較生存率；兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中Cdc42的表達(dá)Cdc42表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。Cdc42表達(dá)朝向腺管中心，為向心性表達(dá)，表達(dá)背離腺管中心為離心性表達(dá)(圖1、2)，本實(shí)驗(yàn)中有45.96%(91/198)病例伴Cdc42的離心性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，Cdc42離心性表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤深度(P=0.011)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.001)密切相關(guān)，與患者性別、年齡無關(guān)(P均>0.05，表2)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)(P<0.001，圖3)。

圖1 免疫熒光法檢測Cdc42在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

圖2 免疫組化法檢測Cdc42在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)：A.Cdc42呈離心性表達(dá)；B.Cdc42呈向心性表達(dá)，EnVision兩步法

圖3 Cdc42不同表達(dá)模式與患者預(yù)后的關(guān)系

表2 Cdc42表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 Cdc42離心性表達(dá)伴E-cadherin表達(dá)缺失Cdc42離心性表達(dá)的病例做連續(xù)切片，檢測同一位置的E-cadherin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有73.63%(67/91)伴有E-cadherin表達(dá)缺失(圖4)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，伴E-cadherin表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌浸潤深度(P=0.006)密切相關(guān)，而與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05，表3)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)(P<0.001，圖5)。

圖4 Cdc42離心性表達(dá)伴E-cadherin表達(dá)缺失：A.Cdc42離心性表達(dá)；B.E-cadherin表達(dá)缺失，EnVision兩步法

圖5 Cdc42離心性表達(dá)伴E-cadherin不同表達(dá)模式與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

表3 Cdc42離心性表達(dá)伴E-cadherin缺失與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 Cdc42與E-cadherin表達(dá)之間的關(guān)系實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，Cdc42在SW480細(xì)胞中呈低表達(dá)。選取SW480細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)Cdc42處理，驗(yàn)證過表達(dá)效率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測結(jié)果均顯示，當(dāng)Cdc42過表達(dá)時(shí)E-cadherin表達(dá)下調(diào)(圖6)。

圖6 Cdc42與E-cadherin表達(dá)之間的關(guān)系：A.Cdc42在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)；B.過表達(dá)Cdc42使E-cadherin的mRNA水平下調(diào)；C.過表達(dá)Cdc42使E-cadherin的蛋白水平下調(diào)

3 討論

近年結(jié)直腸癌的早期診斷和治療雖取得極大的進(jìn)展，但腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的主要原因。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多分子參與的過程[8]。首先是細(xì)胞間黏附能力的喪失，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，該過程稱為上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[9]。EMT轉(zhuǎn)變過程由多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路參與，包括ZEB1、ZEB2、Twist、Snail、Slug等，各種信號通路如TGF-β、Wnt信號通路、PI3K/AKT軸等[10-11]，E-cadherin分子在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。E-cadherin由CDH1基因編碼，位于染色體16q22.1上，屬于Ⅰ型鈣黏蛋白，成熟的E-cadherin蛋白是一種Ca2+依賴性跨膜糖蛋白分子，胞外域由5個(gè)鈣黏蛋白重復(fù)序列(EC)組成，與鄰近細(xì)胞相互作用介導(dǎo)細(xì)胞間黏附；胞內(nèi)域的近膜域(juxtamembrane domain, JMD)與p120結(jié)合，防止E-cadherin的泛素化降解，連環(huán)蛋白結(jié)構(gòu)域(catenin binding domain, CBD)與β-catenin結(jié)合，后者與α-catenin結(jié)合，α-catenin與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)合發(fā)揮作用[12-14]。E-cadherin主要通過黏附連接將正常和極化的上皮細(xì)胞緊密結(jié)合在一起，對于維持組織結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要[15]，E-cadherin表達(dá)缺失是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志，與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。

Cdc42參與腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)過程，如Cdc42參與侵襲性偽足的形成[5]，Cdc42調(diào)控肌球蛋白收縮性從而促進(jìn)腫瘤的侵襲運(yùn)動(dòng)能力[16]。由此可見，Cdc42可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。有研究表明，Cdc42的激活會(huì)促進(jìn)E-cadherin蛋白的溶酶體降解，從而有助于間充質(zhì)表型的發(fā)生[17]，也可以通過其效應(yīng)分子CIP4促進(jìn)β-catenin蛋白易位到細(xì)胞核抑制E-cadherin的表達(dá)[18]。Cdc42在結(jié)直腸癌中表達(dá)分布存在差異，其特異性的離心性表達(dá)與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)[5]，這種特異性的分布是否也與E-cadherin蛋白之間存在關(guān)系，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

免疫組化結(jié)果顯示，Cdc42在結(jié)直腸癌中的離心性表達(dá)與組織浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且伴有離心性表達(dá)的患者預(yù)后不良，提示Cdc42的離心性表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Cdc42離心性表達(dá)的病例中有73.63%伴E-cadherin蛋白的缺失，伴E-cadherin表達(dá)缺失與組織浸潤密切相關(guān)，并且患者預(yù)后明顯更差，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測結(jié)果均顯示，過表達(dá)Cdc42后，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，可初步證實(shí)兩者確實(shí)存在調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，Cdc42在結(jié)直腸癌中離心性表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，預(yù)示患者的不良預(yù)后，這一過程有E-cadherin分子參與，針對兩者的監(jiān)測和靶向可以為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌提供新的治療策略。本文僅初步驗(yàn)證兩者存在的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)仍然存在一定的局限性，其具體的調(diào)控機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探討。