直腸癌組織中嘌呤能離子通道型受體7表達的意義及其與腫瘤細胞特性的關(guān)系

蔣文靜，邸泰霖，紀云兆，孔 磊，王子斌，劉大鵬

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年增加[1]。研究證實[2]，結(jié)直腸癌的發(fā)生是由多個基因參與、多個步驟的復雜過程，與原癌基因和抑癌基因的失衡有關(guān)。在癌癥發(fā)展階段，炎癥細胞會產(chǎn)生大量的活性氧介質(zhì)，在鄰近的上皮細胞中引起DNA損傷和基因突變，或炎癥細胞通過炎性因子的分泌促進了癌前細胞中活性氧介質(zhì)的大量產(chǎn)生，進而促進細胞的癌變[3]。P2受體是與細胞外核苷酸（例如ATP）結(jié)合的一種細胞膜受體[4]。其中，嘌呤能離子通道型受體（P2XR）分為7個亞型，即P2XR1-7，P2XR7是所有P2X嘌呤中最晚被克隆的最新成員，參與腫瘤細胞的生長增殖，甚至在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用[5]。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，P2X7R在上皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞中表達水平顯著升高[6]。為了探討直腸癌P2X7R表達水平及與腫瘤發(fā)生發(fā)展、細胞增殖及侵襲能力的關(guān)系，本研究選取我院收治的直腸癌病理切除標本并結(jié)合體外細胞學實驗進行研究。

1 資料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備 BioTek酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。ChemiDoc MP全方位凝膠成像分析系統(tǒng)儀器；倒置生物顯微鏡37XF購于上海光學儀器一廠。

1.2 主要試劑及細胞株 選取人結(jié)直腸癌細胞株（HCT116）和正常結(jié)腸直腸上皮細胞（NCM460），購自上海藍基生物有限公司。免疫組化染色試劑盒購自北京中山生物制品有限公司。細胞計數(shù)試劑盒（CCK）購自全式金生物公司。1640培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 病例選取 收集2019年10月—2020年10月在我院就診的直腸癌患者手術(shù)切除標本120例，同時選取癌旁組織作為對照，納入標準：1）均經(jīng)病理組織學確診；2）研究前未行放化療等抗腫瘤治療；3）臨床資料完整；4）患者及家屬知情同意。排除標準：1）合并其他惡性腫瘤；2）合并有免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等其他嚴重疾病。

1.4 資料收集 收集患者術(shù)后病理性蠟塊和患者的臨床資料。收集的內(nèi)容包括：性別，年齡，住院時間，腫瘤標志物指癌胚抗原（CEA）、癌抗原19-9（CA19-9）水平，術(shù)前診斷、手術(shù)方法、TNM分期、腫瘤大小、腫瘤分化程度，腫瘤位置、腫瘤浸潤深度、是否存在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量以及是否存在遠處轉(zhuǎn)移等。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸直腸癌細胞系（HCT116）和正常結(jié)腸直腸上皮細胞（NCM460）在含有10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.5.2 免疫組化染色 將手術(shù)切除的標本用10%甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片厚度約4 μm，在60 ℃烘烤3 h，常規(guī)脫蠟，添加3%H2O2孵育10 min，用PBS洗滌3次，每次3 min，檸檬酸溶液修復，在PBS中洗滌，添加一抗并孵育過夜，PBS中洗滌3次，每次3 min，添加聚合物增強劑，在室溫下孵育20 min，每次用PBS洗一抗，添加酶標記的抗小鼠聚合物（二抗），在室溫下孵育30 min，PBS洗滌3次，每次3 min，DAB顯色，然后用蘇木精復染，常規(guī)脫水和固定。評分標準：根據(jù)病理切片中陽性細胞的百分比和染色強度進行半定量免疫組織化學評分以確定結(jié)果。標準為：陽性細胞百分比≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。著色強度：無著色0分，淺黃色1分，黃色為2分，黃色為2分，棕褐色為3分。將以上兩點的乘積作為總分：≤4分為陰性表達，＞4分為陽性表達。

1.4.3 細胞活力檢測 苯甲酰-4-苯甲酰-三硝基苯磺酸（BzATP）是P2X7受體的強大激動劑。CCK法測定細胞活力，方法如下：用無血清培養(yǎng)基將細胞制成細胞懸液，并以5×104/mL的密度接種于96孔板上，每孔100 μL，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。然后除去上清液，加入100 μL含0.01 mmol/L激動劑和0.1 mmol/L激動劑的完全培養(yǎng)基，并在細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。向每個孔中添加10 μL CCK溶液，并繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。于450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD）值。

1.4.4 侵襲實驗 預先預冷實驗中使用的移液器吸頭和EP管。將基質(zhì)膠原蛋白溶液在冰上融化并渦旋混合，然后以1∶5的比例提取并混合，與無血清培基制成基質(zhì)膠工作液。將基質(zhì)膠工作液均勻地分散在Transwell腔室中濾膜上層的底部，輕輕地將其置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中凝膠化4 h，然后向其中添加1640培養(yǎng)基水合1 h。

在上腔室中加入100 μL 1640培養(yǎng)基，在下腔室中加入600 μL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，并在37 ℃下水合1 h，于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中放置24 h。選擇生長狀態(tài)良好的細胞消化和懸浮，并調(diào)整密度為1×106/mL，接種在基質(zhì)膠 Transwell的上腔室中（200 μL/孔），孵育24 h，取出Transwell室，用棉簽快速擦拭過濾器上的基質(zhì)膠，用PBS沖洗3次，并用預冷的95%乙醇固定30 min。常規(guī)HE染色，中性樹膠封固，在200倍光學顯微鏡下隨機選擇濾光片的5個視野進行拍照，計算跨膜細胞的數(shù)量。

1.4.5 Western blotting檢查 將細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，并用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。制備10%分離凝膠和5%濃縮凝膠，電泳轉(zhuǎn)移膜，5%脫脂奶粉封閉劑，置于小鼠抗人PWX7R抗體（1∶3000稀釋度）或小鼠抗人GAPDH（1∶1000稀釋度）中，于90 ℃過夜孵育后，洗滌膜，滴加兔抗小鼠二抗，在室溫下孵育1 h，然后洗滌。將洗凈的PVDF膜放入ChemiDoc MP全方位凝膠成像分析系統(tǒng)儀器中以掃描膜，然后使用Image Lab軟件處理圖像以得到最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌和癌旁組織P2X7R表達比較 直腸癌P2X7R的陽性表達率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 直腸癌和癌旁組織P2X7R陽性表達率比較

2.2 P2X7R表達與直腸癌臨床病理的關(guān)系 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管浸潤直腸癌組織P2X7R陽性表達率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期、無脈管浸潤直腸癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度直腸癌組織P2X7R陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 P2X7R表達與直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 HCT116與NCM460細胞中PWX7R表達比較 HCT116細胞的PWX7R蛋白相對表達量明顯低于NCM460細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表3、圖1。

圖1 HCT116與NCM460細胞中PWX7R表達

表3 HCT116與NCM460細胞PWX7R表達量比較

2.4 各組細胞增殖情況比較 0.01 mmol/L激動劑組、0.1 mmol/L激動劑組細胞培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時OD值明顯低于對照組，0.1 mmol/L激動劑組細胞培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時OD值明顯低于0.01 mmol/L激動劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組細胞增殖情況（OD值）比較

2.5 各組細胞侵襲率比較 0.01 mmol/L激動劑組、0.1 mmol/L激動劑組細胞侵襲數(shù)低于對照組，0.1 mmol/L激動劑組細胞侵襲數(shù)明顯低于0.01 mmol/L激動劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5、圖2。

圖2 各組細胞侵襲圖

表5 各組細胞侵襲情況比較

2.5 各組細胞蛋白相對表達量比較 0.01 mmol/L激動劑組、0.1 mmol/L激動劑組p-STAT3、PWX7R蛋白相對表達量高于對照組，0.1 mmol/L激動劑組p-STAT3、PWX7R蛋白相對表達量明顯低于0.01 mmol/L激動劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表6和圖 3。

表6 各組細胞p-STAT3、PWX7R蛋白相對表達量比較

圖3 各組Western blotting檢查圖

3 討論

目前，結(jié)直腸癌的病因尚不十分清楚，是多基因相互作用和多個信號通路參與的結(jié)果。三磷酸腺苷（ATP）是直接能量供應分子，并且可以在細胞外發(fā)揮信號分子和神經(jīng)傳遞分子的作用[7]。P2X7R是ATP門控的非選擇性陽離子通道，而ATP是P2X7受體的唯一已知內(nèi)源性激活劑，主要在免疫細胞中表達[8]，目前也有發(fā)現(xiàn)它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞中大量表達[9]。P2X7R主要調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡。有研究表明[10-11]抑制P2X7R可以誘導腫瘤生長，而激活P2X7受體則可以誘導腫瘤細胞死亡。

本研究結(jié)果顯示，直腸癌P2X7R陽性表達率明顯低于癌旁組織，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管浸潤直腸癌組織P2X7R陽性表達率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期、無脈管浸潤直腸癌組織，證實了P2X7R的表達在直腸癌組織中顯著下調(diào)，并且其表達與腫瘤TNM分期和血管侵襲顯著相關(guān)。P2X7R在直腸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。P2X7受體可以通過以下方式抑制腫瘤的發(fā)生[10-12]：1）P2X7受體的激活可以直接抑制腫瘤細胞的增殖；2）P2X7受體激活可顯著增加腸道炎性因子水平，增強腸道免疫細胞的功能，從而抑制腸道腫瘤的發(fā)生。3）大腸癌組織中的Tregs具有很強的免疫抑制功能，可以促進腫瘤細胞的免疫逃逸。并且本研究中結(jié)直腸癌細胞PWX7R蛋白相對表達量明顯低于正常結(jié)直腸上皮細胞，結(jié)果與組織中PWX7R蛋白表達情況一致。

本研究中，0.01 mmol/L激動劑組、0.1 mmol/L激動劑組細胞培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時OD值明顯低于對照組，其中0.1 mmol/L激動劑組細胞培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時OD值明顯低于0.01 mmol/L激動劑組，提示P2X7R激動劑 BzATP可導致結(jié)直腸癌細胞活力顯著降低，特別是高濃度的BzATP。該結(jié)果表明結(jié)直腸癌細胞上可能還有其他未知途徑介導BzATP對降低HCT116細胞活力的影響。0.01 mmol/L激動劑組、0.1 mmol/L激動劑組細胞侵襲數(shù)低于對照組，其中0.1 mmol/L激動劑組細胞侵襲數(shù)明顯低于0.01 mmol/L激動劑組。BzATP在高濃度下表現(xiàn)出明顯的抑制增殖效應。研究表明[13-15]P2X7R的激活可以直接抑制腫瘤細胞的增殖，而P2X7R的拮抗作用可以顯著促進癌細胞株的增殖。

STAT3被激活后可以形成同型二聚體，并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞核并與DNA結(jié)合，調(diào)控細胞周期、細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程[16-18]，參與細胞的各種功能。腸上皮細胞STAT3的失活不僅可以影響急性或慢性腸炎中腸細胞的存活和增殖，而且可以減少結(jié)直腸癌模型中腸腫瘤的數(shù)量[19-20]。本研究結(jié)果顯示，0.01 mmol/L激動劑組、0.1 mmol/L激動劑組p-STAT3、PWX7R蛋白相對表達量高于對照組，其中0.1 mmol/L激動劑組p-STAT3、PWX7R蛋白相對表達量明顯低于0.01 mmol/L激動劑組。1 mmol/L BzATP顯著抑制STAT3的磷酸化，表明P2X7受體可能通過抑制STAT3的激活而抑制腫瘤細胞的增殖，并在結(jié)直腸癌的進程中起抑制作用。結(jié)合本實驗在細胞系上的結(jié)果，P2X7R的激活可以抑制腸道腫瘤細胞中STAT3的激活，這與P2X7R抑制結(jié)直腸癌進展是一致的。下一步研究還需要進一步確定哪些蛋白主要受STAT3的激活和抑制的影響，從而影響結(jié)直腸癌細胞的增殖。

綜上所述，直腸癌P2X7R表達下調(diào)，與腫瘤分期及脈管浸潤有關(guān)，表明P2X7R可能抑制結(jié)直腸癌的進展，其可能的機制之一是P2X7R抑制了腸道腫瘤細胞中STAT3的激活。