益氣化瘀方調控PI3K/AKT/mTOR信號通路對糖尿病潰瘍大鼠外周神經修復的作用

何斌俊，邢 捷，闕華發(fā)

糖尿病潰瘍是糖尿病常見的并發(fā)癥之一。糖尿病潰瘍有神經病理性、缺血性和神經-缺血性三種類型。神經病變會使患者對溫度和壓力的感覺減弱，創(chuàng)傷、潰瘍不易被察覺。糖尿病神經病變會使?jié)儼l(fā)生的風險增加15%，潰瘍復發(fā)的風險是正常人的7倍[1]。據國際糖尿病聯合會(IDF)的數據統(tǒng)計顯示，截至2019年，全球已有糖尿病患者4.63億例，其中有（4000～6000）萬糖尿病患者患有神經和（或）血管損傷及糖尿病潰瘍并發(fā)癥[2]。P物質是由外周神經釋放的神經肽，參與創(chuàng)面愈合并發(fā)揮著重要作用。神經生長因子（nerve growth factor,NGF）是一種二聚體蛋白，在神經元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性表達方面有重要的調控作用。研究發(fā)現，益氣化瘀方治療糖尿病潰瘍療效顯著，同時，動物實驗發(fā)現其對糖尿病大鼠神經修復有較好作用[3-4]。本實驗旨在探討益氣化瘀方是否能通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路影響NGF、P物質的表達，影響糖尿病潰瘍大鼠外周神經的修復。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠共30只，體質量（160±10）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬 )2017-0011。

1.2 藥物 益氣化瘀方由生黃芪30 g，太子參30 g，黃精15 g，丹參30 g，桃仁12 g，地龍12 g組成，將以上中藥煎取、濃縮，4 ℃冰箱保存。

1.3 試劑及儀器 鏈脲佐菌素（streptozocin,STZ）（批號：WXBD1402V），日本Sigma公司；雷帕霉素（貨號：S1039），美國Selleck Chemicals公司；舒泰50注射用麻醉劑（批號：BN7NWF），法國維克有限公司；LY294002（貨號：040419200521），上海碧云天生物技術有限公司；ECL顯色試劑盒（批號：P0018FS），上海碧云天生物技術有限公司；一抗NGF（貨號：Ab52918），美國abcam公司；一抗GAPDH（貨號：5174），CST公司；HRP標記山羊抗兔IgG抗體（貨號：A0208），上海碧云天生物技術有限公司；大鼠P物質ELISA試劑盒（貨號：CSBE08358r），CUSABIO 公司；Trizol（貨號：15596018），賽默飛公司；反轉錄試劑盒（貨號：RR037A），TAKARA公司；RT-PCR試劑盒（貨號：RR820B），TAKARA公司；酶標儀（型號：Synergy H1MF），美國Biotek公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號：Chemiscope 6300），上海勤翔科學儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀（型號：7500fast），美國ABI公司；肌電圖儀（型號：NTS-2000），上海諾誠電氣有限公司。

1.4 動物造模 配制pH值為4.32、濃度為0.1 mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液，溶解STZ配制成1%溶液。以55 mg/kg體質量單次向大鼠腹腔注射1%STZ-檸檬酸鈉溶液，72 h后隨機血糖大于16.7 mmol/L，為糖尿病造模成功[5]。成模后飼養(yǎng)6周，在舒泰50麻醉下，用肌電圖儀測量大鼠尾部感覺神經傳導速度，以尾部感覺神經傳導速度（SNCV）＜30 m/s作為糖尿病周圍神經病變成模標準[6]。糖尿病周圍神經病變成模后，所有大鼠以40 mg/kg體質量腹腔注射舒泰50，腰背部備皮，以直徑2 cm的模具標記造模區(qū)，切除全層皮膚[7]。

1.5 分組與給藥 通過SPSS25.0軟件產生隨機數字，將30只大鼠分成正常組6只、糖尿病組24只，成模后將24只糖尿病大鼠隨機分入模型組、益氣化瘀方（YQHYF）組、益氣化瘀方+PI3K抑制劑（YQHY+LY）組、益氣化瘀方+mTOR抑制劑（YQHY+RA）組，每組6只。創(chuàng)面造模后次日給藥，YQHYF組、YQHY+LY組、YQHY+RA組中藥灌胃2 mL/d。YQHY+LY組在中藥灌胃同時按1 mg/kg腹腔注射LY294002 0.2 mL/d，YQHY+RA組在中藥灌胃同時按3 mg/kg腹腔注射雷帕霉素0.2 mL/d；正常組、模型組生理鹽水灌胃2 mL/d。各組創(chuàng)面每天均用1:5000呋喃西林溶液清潔。

1.6 神經傳導速度檢測 分別在給藥前和給藥第21天使用肌電圖儀測各組鼠的神經傳導速度。

1.7 透射電鏡神經形態(tài)學觀察 給藥第21天，麻醉大鼠，迅速取各組大鼠坐骨神經組織，經固定、脫水、包埋固化后，切成超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染后，用透射電鏡觀察形態(tài)。

1.8 ELISA 給藥第21天，取各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織，勻漿后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在450 nm波長處檢測創(chuàng)面神經肽P物質的吸光度，計算含量。

1.9 Western blotting 給藥第21天，取各組鼠創(chuàng)面肉芽組織50 mg，加入RIPA裂解液500μL，勻漿組織與裂解，取上清液檢測樣本蛋白濃度。蛋白變性后，經10%SDS-PAGE膠電泳分離，轉移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中封閉40 min，加入一抗（NGF 1:1000，GAPDH 1:2000）4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入二抗（1:1000）室溫孵育40 min，TBST洗膜，滴加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光檢測，用Image J軟件進行圖像灰度分析。

1.10 實時定量PCR 給藥第21天，取各組鼠創(chuàng)面肉芽組織，加入Trizol提取總RNA，分光光度計檢測RNA濃度，使用反轉錄、PCR試劑盒合成cDNA，并擴增，以β-actin為內參，反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72℃延伸30 s（40個循環(huán)）。采用2-△△Ct法計算NGF mRNA表達。引物由上海英俊生物技術有限公司合成，序列如下，NGF正向：5’-AACACTTTGTGGCCTGAACC-3’，反向：5’-AGGCAGAGGAAGACGATGAA-3’；β-actin 正向：5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’，方向：5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’。

2 結果

2.1 神經傳導速度 給藥前，與正常組比較，模型組、YQHYF組、YQHY+LY組、YQHY+RA組神經傳導均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在給藥第21天，與正常組比較，其余各組神經傳導速度均降低；與模型組比較，YQHYF組神經傳導速度升高；與YQHYF組比較，YQHY+LY組、YQHY+RA組神經傳導均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 給藥前后各組動物SNCV比較

2.2 坐骨神經形態(tài)學 在給藥第21天，正常組有髓神經纖維髓鞘、軸索內結構均完整；模型組髓鞘板層結構分離，軸索萎縮；YQHYF組有髓神經纖維髓鞘板層輕度分離；YQHY+LY組、YQHY+RA組有髓神經纖維髓鞘板狀分離，軸索內線粒體聚集，微絲微管紊亂，雪旺細胞腫脹。見圖1。

圖1 各組大鼠坐骨神經形態(tài)改變（×6 000）

2.3 創(chuàng)面神經肽P物質的表達 給藥第21天，與正常組比較，模型組P物質濃度顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，YQHYF組P物質濃度顯著增加；與益氣化瘀方組比較，YQHY+LY組、YQHY+RA組P物質濃度均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組給藥第21天創(chuàng)面P物質濃度比較

2.4 創(chuàng)面組織NGF蛋白的表達 給藥第21天，與正常組比較，模型組NGF蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，YQHYF組NGF蛋白表達增加；與YQHYF組比較，YQHY+LY組、YQHY+RA組NGF蛋白表達均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 給藥第21天各組NGF蛋白表達

2.5 創(chuàng)面組織NGF mRNA的表達 給藥第21天，與正常組比較，模型組NGF mRNA相對表達量顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，YQHYF組NGF mRNA相對表達量顯著增加（P＜0.01）；與YQHYF組比較，YQHY+LY組、YQHY+RA組NGF mRNA相對表達量顯著減少（P＜0.01）。見表2。

表2 給藥第21天各組NGF蛋白和NGF mRNA表達水平比較

3 討論

糖尿病性潰瘍是一種以外周神經病變和外周動脈病變?yōu)榛A的慢性難愈合創(chuàng)面[1]。Reiber等[8]研究顯示，45%～60%的足部潰瘍完全是由外周神經病變引起的。臨床和基礎研究證實，外周神經病變的發(fā)生是以異常的葡萄糖代謝為基礎的，高血糖促進多元醇途徑、蛋白激酶C途徑、糖基化終末產物途徑、多聚核糖聚合酶和氨基己糖合成途徑激活，通過影響胰島素信號通路，對線粒體功能、基因表達和氧化應激產生影響[9]，從而加重外周神經病變。同時，高血糖可引起的周圍神經組織中雪旺細胞（schwann cells,SC）和血管內皮的周細胞代謝紊亂，使血神經屏障、雪旺細胞功能障礙引起周圍神經穩(wěn)態(tài)破壞，誘導產生脫髓鞘等損傷，由于髓鞘被破壞，軸突穩(wěn)態(tài)和再生受損導致周圍神經病變的進展[10]。

創(chuàng)面愈合過程主要由止血、局部炎癥反應、細胞增殖分化和組織重建4個重疊的階段組成[11]，且是一個復雜的病理生理學過程。它涉及不同類型的細胞（如免疫細胞、角質細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞）、細胞因子（成纖維細胞生長因子、轉化生長因子、表皮生長因子、血管內皮生長因子、NGF等）和細胞外基質[12]。創(chuàng)面愈合過程中任何因子的缺失都能導致創(chuàng)面愈合障礙。神經生長因子是發(fā)現最早的神經營養(yǎng)因子，是中樞和外周神經系統(tǒng)發(fā)育和維持的基本神經營養(yǎng)因素[13-14]。SC是外周神經特有的膠質細胞，是外周神經再生微環(huán)境的重要成分，而NGF的重要來源是神經損傷后能分裂增殖的SC[15]。NGF不僅是神經維持正常功能必需的物質，在創(chuàng)面愈合過程也有重要作用[16]，創(chuàng)面肉芽組織所表達的NGF活性，可以促進創(chuàng)面的愈合。在生理過程中，NGF可以通過不同類型的細胞在皮膚組織中持續(xù)表達來維持皮膚穩(wěn)態(tài)[17]。NGF可以調控神經肽P物質的合成，通過參與編碼神經肽P物質的前體分子來調節(jié)其合成[18]。神經肽P物質廣泛分布于神經與血管內皮細胞中，其可促進單核細胞趨化蛋白-1、皮膚特異性干細胞、成纖維細胞、表皮生長因子等多種生長因子表達。同時，在糖尿病足潰瘍中P物質等介質影響創(chuàng)面愈合的整個過程。潰瘍周圍皮膚神經纖維減少，P物質含量下降，引起患者傷口延遲愈合[19]。PI3K/Akt/mTOR信號通路可參與細胞生長、增殖、分化調節(jié)，由PI3激酶產生的磷酸化P3對神經元的存活和發(fā)育有重要作用，同時PI3激酶激活許多靶點，促進軸突生長和神經元分化[20]。NGF對創(chuàng)面再上皮化愈合作用機制與激活PI3K/Akt通路加速真皮成纖維細胞遷移有關[21]。

益氣化瘀方全方由生黃芪30 g、太子參30 g、黃精15 g、丹參30 g、桃仁12 g、地龍12 g組成。前期研究證實益氣化瘀法可促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面血管和神經再生[4,22]。本研究觀察坐骨神經形態(tài)學，檢測神經傳導速度，創(chuàng)面組織P物質、NGF的表達量。結果顯示，糖尿病潰瘍大鼠坐骨神經結構破壞，神經傳導速度下降，創(chuàng)面組織中的P物質含量下降，NGF蛋白和NGF mRNA表達水平下調；而益氣化瘀方可使坐骨神經破壞減輕，神經傳導速度升高，創(chuàng)面組織中P物質含量增加，NGF蛋白和NGF mRNA表達水平上調；益氣化瘀方+PI3K抑制劑組、益氣化瘀方+mTOR抑制劑組的坐骨神經結構破壞，神經傳導速度下降，創(chuàng)面組織中的P物質含量下降，NGF蛋白和NGF mRNA表達水平下調。結果表明益氣化瘀方可能通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路增加外周神經P物質含量，提高NGF表達，改善糖尿病周圍神經病變，提高神經傳導速度，促進糖尿病潰瘍大鼠創(chuàng)面外周神經修復，后續(xù)將進一步深入研究相關機制。