三維同步熒光光譜法同時測定保健食品中維生素B1、B2和B6的含量

張寶成，高 嵐

(1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 蕪湖 241002；2.蕪湖市諾康生物科技有限公司，安徽 蕪湖 241007)

B族維生素是維持人體正常機能與代謝活動不可缺少的水溶性維生素，維生素B1、B2和B6常同時存在于復(fù)合維生素B保健食品中。準確檢測三種維生素的含量一直受到人們的關(guān)注，同時測定多種維生素B常用的方法是高效液相色譜法[1-2]。熒光分析法具有高的靈敏性和選擇性，而且用量少、操作簡單。而維生素B2和B6本身具有熒光性，維生素B1在堿性介質(zhì)中氧化后的產(chǎn)物也具有熒光性，因此，熒光分析法是檢測維生素B1、B2和B6的重要方法之一。但是，由于維生素B1、B2和B6的發(fā)射光譜重疊嚴重，且最佳激發(fā)光波長相差較大，因此，很難用普通熒光光譜法同時準確測定三種維生素的含量。同步熒光技術(shù)是熒光分析技術(shù)的進一步發(fā)展，與普通熒光法相比較，同步熒光法得到的熒光光譜更為窄化，可以減少幾種成分的普通熒光光譜的重疊程度[3]，在測定混合物時較普通熒光法優(yōu)勢明顯[4]。同步熒光法的關(guān)鍵是確定合適的波長間隔(Δλ)。最佳Δλ值可以通過斯托克斯位移大小作出理論上的預(yù)測，但實際上合適的Δλ需要實驗來確認[5]。通常選擇Δλ的方法是先確定幾個值，再通過比較選出相對理想的Δλ值，但是由于Δλ是預(yù)先設(shè)定的幾個值，選出的Δλ值可能不是最佳Δλ。而三維同步熒光光譜可以掃描一系列Δλ與同步熒光光譜的關(guān)系，從中得到最佳Δλ，更接近于實際最佳Δλ，所以三維熒光與同步熒光熒光能更全面地表達樣品信息[6]。三維同步熒光已經(jīng)應(yīng)用于食品分析領(lǐng)域[7]。本研究通過建立維生素B1、B2和B6三維同步熒光光譜，選擇合適的Δλ，運用同步熒光法同時測定保健食品中維生素B1、B2和B6的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Cary Eclipse型熒光分光光度計(美國安捷倫科技公司)，DV215CD 型十萬分之一電子天平(美國奧豪斯公司)。

維生素B1對照品購于上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司，維生素B2和B6對照品購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；奧諾康?多種B族維生素片，規(guī)格：0.5 g/片，購于蕪湖市諾康生物科技有限公司，批號：211009。

pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液按照《中華人民共和國藥典》[8]中的方法配備。堿性鐵氰化鉀溶液的配備：稱取1.0 g鐵氰化鉀配成100 mL鐵氰化鉀溶液，使用時取鐵氰化鉀溶液3 mL，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋至10 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1 維生素B混合對照品溶液的制備

準確稱取維生素B1、B2、B2對照品各10.00 mg，在100 mL容量瓶(本文使用的容量瓶均為棕色)中用0.01 mol/L的鹽酸配成 100 μg/mL儲備液。準確量取10.00 mL三種維生素儲備液至同一100 mL容量瓶中，加入20 mL 0.01 mol/L的鹽酸，再加入1.2 0 mL堿性鐵氰化鉀溶液，搖均放置10 min后，用0.01 mol/L鹽酸定容。分別量取上述混合對照品溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL至5個10 mL容量瓶中，用pH為6.8緩沖溶液定容，配成系列濃度的混合對照品溶液，待測。

1.2.2 供試品溶液的制備

隨機選樣品 10片研細，精密稱取1.000 0 g，用0.01 mol/L鹽酸溶解，并在100 mL容量瓶中定容，作為樣品儲備液。準確量取25.00 mL樣品儲備液至100 mL容量瓶中，先加入25 mL 0.01 mol/L的鹽酸，接著加入1.20 mL堿性鐵氰化鉀溶液，搖均放置10 min后，再用0.01 mol/L鹽酸定容。上述供試品溶液經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取離心液1.00 mL至10 mL容量瓶中，用pH為6.8緩沖溶液定容，待測。

1.2.3 三維同步熒光光譜的測定

選擇激發(fā)光譜和發(fā)射光譜通帶寬度均為 5 nm，Δλ掃描范圍為 40～120 nm，增量為5 nm，掃描混合對照品溶液和供試品溶液的三維同步熒光光譜，做出等高線圖譜和立體圖譜，確定同時測定三種維生素的最佳Δλ值。

1.2.4 維生素B含量的測定

在Δλ=72 nm 的條件下，測定系列濃度混合對照品溶液的同步熒光強度，繪制標準曲線，得出回歸方程式。然后在相同的條件下測定供試品的同步熒光強度，根據(jù)回歸方程式算出三種維生素B的含量。

2 實驗結(jié)果

2.1 熒光光譜

維生素B1、B2和B6的普通熒光光譜和同步熒光光譜如圖1 所示，可以看出，三種維生素的普通熒光光譜重疊嚴重(圖1a)，而同步熒光的譜帶更加窄化，光譜重疊現(xiàn)象減少(圖1b)。

(a)普通熒光光譜

2.2 三維熒光光譜

2.2.1 三維普通熒光光譜

維生素B1、B2和B6的三維普通熒光光譜如圖2所示。等高線圖顯示，三種維生素B的激發(fā)波長不存在共同波段。立體圖顯示激發(fā)波長的改變對熒光發(fā)射強度影響較大，因此，普通熒光光譜法難以同時準確測定三種維生素的含量。

(a)維生素B1三維普通熒光光譜等高線圖 (b)維生素B1三維普通熒光光譜立體圖

2.2.2 三維同步熒光光譜

維生素B1、B2和B6的三維同步熒光光譜如圖3所示。

(a)維生素B1三維同步熒光光譜等高線圖 (b)維生素B1三維同步熒光光譜立體圖

通過進一步減小Δλ的增量進行掃描，得到維生素B1最佳Δλ是72 nm，維生素B2最佳Δλ是76 nm，維生素B6最佳Δλ是68 nm。但是等高線圖和立體圖都顯示，盡管三種維生素B的同步發(fā)射譜帶較狹窄，但是其Δλ更為寬泛，即Δλ在一定的范圍內(nèi)對同步發(fā)射影響較小，因此可以選擇適當?shù)牟ㄩL作為維生素B1、B2和B6的共同Δλ。根據(jù)進一步減小增量掃描的結(jié)果，確定72 nm作為共同的Δλ。

維生素B1、B2和B6混合對照品的三維同步熒光光譜如圖4所示，同樣顯示Δλ=72 nm時，三種維生素的同步發(fā)射信號都處于最強點或極接近最強點(圖4a)。以Δλ=72 nm掃描混合對照品得到的同步光譜顯示，三種維生素較好地保持了各自的同步發(fā)射峰(圖4b)。

(a)普通同步熒光光譜 (b)三維同步熒光光譜圖4 混合對照品的同步熒光光譜

供試品溶液的三維同步熒光光譜(圖5a)和以Δλ=72 nm掃描得到的同步光譜(圖5b)都顯示與混合對照品光譜具有類似的特征。

(a)普通同步熒光光譜 (b)三維同步熒光光譜圖5 樣品的同步熒光光譜

2.3 標準曲線與檢出限

以Δλ=72 nm掃描系列濃度混合對照品溶液同步熒光光譜，再以質(zhì)量濃度為橫軸(X)，熒光強度為縱軸(Y)進行回歸分析，結(jié)果如表1所示，三種維生素B在0.25～2.00 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。檢出限D(zhuǎn)=3×Sb/S，Sb為空白試樣測試 11 次的標準偏差,S為回歸方程的斜率，得到三種維生素的檢出限(表1)。

表1 三種維生素的線性關(guān)系與檢出限

2.4 精密度考察

取同一份樣品供試液，按照“1.2.4”方法測定6次，測得維生素B1、B2和B6同步熒光峰強度值RSD分別為0.33%、0.29%和0.24%，說明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性考察

稱取樣品6份，按“1.2.4”方法制備供試液，以Δλ=72 nm測定維生素B1、B2、B6同步熒光光譜，并計算含量，所得結(jié)果的RSD分別為4.64%、2.54%和3.72%，說明該方法重復(fù)性較好。

2.6 加樣回收率實驗

量取6份已知濃度的樣品供試液(維生素B1：7.66 μg/mL，維生素B2：7.59 μg/mL，維生素B6：7.43 μg/mL)，加入與樣品含量大致相當?shù)幕旌蠘藴势芬?，按照?.2.4”方法測試，維生素B1、B2和B6的平均回收率分別為101.03%、100.18%和98.33%，RSD 分別為4.13%、1.95%和2.32%，表明此方法回收率較好。結(jié)果見表 2。

表2 加標回收率實驗結(jié)果

2.7 樣品測定

按照“1.2.4 ”方法測定樣品中三種維生素的含量，以1.000 0 g原樣含量計，結(jié)果見表3“同時測定”。同時，以三種維生素B以各自的最佳Δλ進行測定，即維生素B1的Δλ為72 nm(與同時測定相同，不再進行單獨測定)、維生素B2的Δλ為76 nm、維生素B6的Δλ為68 nm，測得結(jié)果見表3“分別測定”。兩種方法測得的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 樣品中三種維生素B含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

由于同步熒光的光譜比普通熒光譜更為窄化，而且Δλ的選擇范圍較大，因此，同步熒光法用于熒光物質(zhì)含量測定時，具有更大的優(yōu)勢。同步熒光法的關(guān)鍵是選擇合適的Δλ，而三維同步熒光光譜預(yù)先設(shè)置掃描間隔，準確地得到最佳Δλ。本研究測定保健食品中維生素B1、B2和B6含量，保健食品中除了三類維生素B與輔料之外，往往還含有其它功效成分，如本實驗樣品的標識顯示還含有煙酰堿、泛酸等成分，因此對同時測定幾種維生素B可能產(chǎn)生影響。本研究通過掃描維生素B1、B2和B6三維同步熒光光譜，發(fā)現(xiàn)三者的最佳Δλ較接近，選擇Δλ=72 nm作為三者的共同同步波長檢測三者的含量，Δλ的偏差對三者的影響較小。同時檢測維生素B1、B2和B6三者的含量，由于維生素B1需要先在堿性條件下氧化，氧化時間、溶液的酸堿性和反應(yīng)的時間不僅對維生素B1產(chǎn)生影響，同時也可能對維生素B2和B6有一定的影響，在實驗中發(fā)現(xiàn)，多次測量樣品時產(chǎn)生的偏差偏大。

本研究通過三維同步熒光光譜法同時測定保健食品中維生素B1、B2和B6含量的方法，維生素B1、B2、B6的同步熒光光譜重疊程度較少，最佳Δλ較接近，選擇72 nm作為共同同步波長，結(jié)果顯示樣品中含維生素B1、B2和B6分別為2.979 2、2.929 5、2.923 9 mg。本方法簡單，準確度高，結(jié)果可靠，可同作為同時測定維生素B1、B2和B6含量的方法，但是輔料及其它功效成分的影響還需要進一步研究。