龍膽苦苷對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用及對PI3K/AKT信號通路的影響

解娜 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

活性氧(ROS)積累引起的氧化應(yīng)激損傷是包括缺血/再灌注損傷在內(nèi)的多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制〔1〕。在病理情況下，ROS產(chǎn)生和清除失去平衡，大量的ROS能夠攻擊DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致心肌細胞中抗氧化酶的耗竭或失活，繼而導(dǎo)致細胞損傷甚至細胞凋亡〔2〕。龍膽苦苷(GPS)為從龍膽科植物中提取的含環(huán)烯醚萜苷類主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、保肝利膽等多種藥理活性〔3〕。此外，GPS還可提高心臟收縮能力和心肌細胞抗凋亡能力，明顯減輕缺血再灌注對心臟的損傷〔4,5〕。然而，GPS心肌保護作用機制并不明確。H9C2是從大鼠胚胎期心臟分離的細胞系，具有分裂能力，是研究心血管疾病的理想細胞模型〔6〕。本研究通過探究GPS對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激損傷、凋亡的影響，初步探討其潛在分子機制，以期為GPS抗心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的深入研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料 大鼠心肌細胞H9C2購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國GIBCO公司；青鏈霉素雙抗溶液及丙二醛(MDA)、乳酸鹽脫氫酶(LDH)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于北京索萊寶生物公司；GPS(批號110770-201817，純度98.2%)購于中國食品藥品檢定研究院；噻唑藍(MTT)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物公司；兔源裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3抗體、兔源B淋巴細胞瘤(Bcl)-2抗體，兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體，兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗體，兔源PI3K抗體，兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體，兔源AKT抗體購于美國CST公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建和分組 采用DMEM培養(yǎng)液于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2細胞。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，1%的青鏈霉素雙抗溶液。采用700 μmol/L的H2O2孵育H9C2細胞24 h復(fù)制心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型〔7〕。為檢測GPS對H9C2細胞的毒作用，用含不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L)GPS的培養(yǎng)液孵育H9C2細胞24 h，MTT法檢測細胞活力，確定后續(xù)試驗GPS濃度。實驗分為正常對照(NC)組、H2O2組(700 μmol/L H2O2孵育24 h)、H2O2+GPS組(10、20、40 μmol/L的GPS預(yù)處理24 h，其余同H2O2組)。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 取1×104個H9C2細胞接種96孔板，按照實驗分組進行細胞處理，隨后棄去細胞培養(yǎng)液，每孔加入10 μl的MTT溶液和100 μl的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，加入100 μl的二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處光密度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=〔(OD實驗孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)〕×100%

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 H9C2細胞按照上述分組干預(yù)后，胰酶消化后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用適量結(jié)合緩沖液調(diào)整為單細胞懸液。取100 μl加入流式管，分別加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl丙化碘啶(PI)，避光孵育15 min，補加結(jié)合緩沖液400 μl?；靹蚝?，上機檢測細胞凋亡情況。

1.2.4心肌細胞損傷和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 H9C2細胞按照上述分組干預(yù)后，吸取細胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說明檢測MDA含量及LDH、AST、CK釋放量。超聲波破碎各組H9C2細胞，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明檢測CAT、SOD和GSH-Px活性及ROS水平。

1.2.5Western印跡檢測Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax和PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平 用預(yù)冷的細胞裂解液分別提取H9C2細胞總蛋白。蛋白定量后，取適量蛋白與等體積上樣緩沖液混合，煮沸3 min使其變性。取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將分離的細胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜。將NC膜置于5%脫脂牛奶中37℃封閉1 h。洗膜后，將其置于1∶1 000稀釋的一抗溶液中37℃孵育2 h。洗膜后，將其置于二抗溶液中37℃孵育1 h。將膜置于化學(xué)發(fā)光顯色液中避光顯影。以β-actin為內(nèi)參，圖像處理軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度龍膽苦苷對心肌細胞存活的影響 用不同濃度的龍膽苦苷干預(yù)H9C2細胞24 h，MTT法檢測細胞存活率顯示，NC組、GPS 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L組細胞存活率分別為(101.82±2.68)%、(103.78±1.86)%、(108.46±6.30)%、(105.59±6.81)%、(107.51±0.99)%、(99.10±2.04)%、(93.71±5.45)%、(79.24±2.22)%。當(dāng)GPS濃度達到20.0 μmol/L時H9C2細胞存活率顯著升高，當(dāng)GPS濃度達到80.0 μmol/L時對H9C2細胞表現(xiàn)出顯著的細胞毒作用。選擇10.0、20.0、40.0 μmol/L的GPS濃度進行后續(xù)實驗。

2.2不同濃度龍膽苦苷對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞上清液中LDH、AST、CK釋放量、MDA含量顯著升高；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞上清液中LDH、AST、CK釋放量、MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度龍膽苦苷促進H2O2處理對心肌細胞損傷、凋亡及Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

2.3不同濃度龍膽苦苷對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞凋亡率顯著升高；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1和圖1。

2.4不同濃度龍膽苦苷對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡蛋白表達的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達顯著升高、Bcl-2蛋白表達顯著降低；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達顯著降低、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2。

2.5不同濃度的龍膽苦苷對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞活性氧產(chǎn)生的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞ROS含量顯著升高；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞ROS含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

圖1 流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡

2.6不同濃度的龍膽苦苷對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞CAT、SOD和GSH-Px活性的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞CAT、SOD和GSH-Px活性顯著降低；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞CAT、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.7不同濃度龍膽苦苷對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞AKT信號通路的影響 與NC組比較，H2O2組H9C2細胞p-PI3K和p-AKT表達水平顯著降低；與H2O2組比較，H2O2+GPS 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組H9C2細胞p-PI3K和p-AKT表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2和圖3。

表2 不同濃度龍膽苦苷H2O2處理心肌細胞ROS、CAT、SOD、GSH-Px、p-PI3K、PI3K、AKT和p-AKT表達的影響

圖3 檢測心肌細胞中p-PI3K、PI3K AKT和p-AKT蛋白表達

3 討 論

GPS作為一種傳統(tǒng)中藥，在我國已廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胃痛等疼痛和炎癥性疾病。研究顯示，GPS可能通過抗炎、抗氧化機制對大鼠骨關(guān)節(jié)炎、乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜損傷具有保護作用〔8,9〕。GPS通過抑制核因子-κB和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路減輕星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)進而預(yù)防神經(jīng)元損傷〔10〕。此外，GPS還可減輕內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡，發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用〔11〕。

H2O2是超氧陰離子、羥基自由基等高活性氧自由基的主要前體，可誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡。MDA是細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，其含量高低可反映細胞氧化損傷程度〔12〕。正常心肌細胞內(nèi)存在LDH、AST、CK等多種心肌酶類，其釋放量增加提示細胞通透性改變或細胞損傷〔13〕。CAT、SOD和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化化酶，可抑制自由基產(chǎn)生，平衡機體代謝，然而ROS的大量產(chǎn)生導(dǎo)致CAT、SOD和GSH-Px耗竭，破壞機體氧化和抗氧化動態(tài)平衡，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷〔12〕。本研究顯示，GPS預(yù)處理可顯著提高H2O2誘導(dǎo)的H9C2細胞中CAT、SOD和GSH-Px活性，降低細胞ROS水平，抑制MDA產(chǎn)生以及LDH、AST、CK的釋放，提示GPS可能通過增強H9C2細胞抗氧化能力減輕H2O2誘導(dǎo)H9C2細胞損傷。

過量的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡〔14〕。Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax細胞是參與細胞凋亡調(diào)控的重要蛋白。Bcl-2和Bax屬于Bcl家族，Bax表達增加可促進線粒體細胞膜電位改變，促進細胞色素C釋放，激活caspase途徑促進細胞凋亡發(fā)生，而Bcl-2則通過與Bax結(jié)合形成異源二聚體發(fā)揮抗凋亡作用〔15〕。本研究顯示，GPS預(yù)處理可減輕H2O2誘導(dǎo)H9C2細胞凋亡，提高Bcl-2表達，降低Cleaved caspase-3和Bax表達水平，提示GPS可能通過線粒體途徑抑制H2O2誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)細胞生存、生長和凋亡的重要細胞內(nèi)信號通路〔16〕。研究顯示，PI3K/AKT通路的激活可促進心肌細胞的存活，保護心臟免受缺血/再灌注損傷，抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡〔17,18〕。此外，GPS可能激活PI3K/AKT信號通路對人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷具有保護作用〔11〕。為探討GPS對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細胞損傷保護作用機制，本研究檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平，結(jié)果顯示GPS預(yù)處理可降低H2O2誘導(dǎo)對PI3K、AKT磷酸化的抑制作用，提示GPS對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細胞保護作用可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。綜上所述，GPS可減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)，這為GPS用于預(yù)防心肌細胞氧化應(yīng)激損傷奠定了理論基礎(chǔ)。