聯(lián)合早期腸內(nèi)營養(yǎng)和生態(tài)免疫腸內(nèi)營養(yǎng)對重癥急性胰腺炎大鼠腎功能保護(hù)作用

逄澤輝 王慶華 (濱州醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)人文教研室，山東 濱州 256603)

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的急危重癥，其發(fā)生、發(fā)展與抗炎因子、促炎因子、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)〔1〕，對機(jī)體微循環(huán)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，導(dǎo)致肝、肺及腎等相關(guān)器官衰竭〔2〕。其急性腎損傷(AKI)發(fā)生率高達(dá)35%，合并急性腎衰竭(ARF)后病死率明顯上升，高達(dá)80%〔3〕。早期腸內(nèi)營養(yǎng)(EEN)指患者入院24～72 h內(nèi)盡早實(shí)行EEN。生態(tài)免疫腸內(nèi)營養(yǎng)(EIN)即在腸內(nèi)營養(yǎng)的基礎(chǔ)上，添加益生菌、谷氨酰胺和精氨酸等對免疫功能有重要影響的免疫營養(yǎng)素輔助治療〔4〕，從而抑制外源性致病菌和內(nèi)源性條件致病菌的過度生長和繁殖。本研究旨在探討聯(lián)合EEN和EIN對SAP大鼠腎功能保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取健康清潔級雄性SD大鼠120只，體重(250±30)g，由山東濟(jì)南鵬悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供〔動物合格證號：SCXK(魯)20140007〕，SD大鼠先在動物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w。隨機(jī)分為4組：正常對照(SO)組，SAP模型(SAP)組，EEN組，EIN組。每組30只，將每組再分為12、24、48 h 3個亞組(n=10)。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)動物模型制備 SAP大鼠采用逆行胰膽管注射5%?；悄懰徕c法制備模型。用10%水合氯醛溶液對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)，在劍突下腹正中處縱行約2 cm的手術(shù)切口，逐層切開循腔入腹，沿胃竇幽門找到十二指腸，于十二指腸內(nèi)側(cè)可見片狀分布胰腺，進(jìn)一步尋找十二指腸乳頭及透明狀胰膽管，給予無損動脈夾夾閉胰膽管近肝端，用尖端磨鈍的一次性0.45號靜脈輸液針經(jīng)胰膽管十二指腸開口處逆行穿刺入主胰膽管，用無損動脈夾固定針頭。向胰膽管內(nèi)緩慢注入5%?；悄懰徕c溶液(0.1 ml/100 g)，無菌鹽水紗布覆蓋手術(shù)區(qū)，當(dāng)胰腺發(fā)生水腫滲出、局部出現(xiàn)暗紅色時，證明造模成功。最后將十二指腸還納至腹腔內(nèi)后逐層關(guān)腹。術(shù)后于大鼠背部皮下注射生理鹽水(2 ml/100 g)以補(bǔ)充丟失的體液，術(shù)后大鼠自由飲水，但仍禁食。SO組：手術(shù)方式同上，但開腹后胰膽管注射等量生理鹽水。

1.3營養(yǎng)途徑的建立 (1)腸內(nèi)營養(yǎng)液配制：用百普素(Milupa GmbH，德國)配制，在潔凈容器中注入500 ml冷水，加入本品1袋(125 g)，充分混合。其主要成分為：水解乳清蛋白、麥芽糖糊精、植物油、礦物質(zhì)、維生素、微量元素等。(2)EIN組：在EEN組腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑中加入谷氨酰胺(L-Gln，成都藥業(yè)股份有限公司)0.4 g/(kg·d)、精氨酸(L-Arg，上海信誼制藥廠)0.25 g/(kg·d)、三聯(lián)活菌制劑(長型雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司)109CFU/d。(3)所有大鼠腸內(nèi)營養(yǎng)喂養(yǎng)途徑采用胃十二指腸置管方法，大鼠術(shù)后清醒4 h后給予2 ml生理鹽水沖洗腸管，SAP建模后12 h起間歇緩慢泵入營養(yǎng)液(10 min/次，5 ml/1.5 h)，總量逐漸增加至50 ml/24 h，能量達(dá)到250 kCal/(kg·d)，并采用微量輸液泵維持。營養(yǎng)過程中，觀察大鼠適應(yīng)性，根據(jù)情況調(diào)整營養(yǎng)液速度。SAP組和SO組經(jīng)腸內(nèi)營養(yǎng)管注入等量生理鹽水。

1.4方法

1.4.1各組炎癥反應(yīng)指標(biāo) 分別在各亞組營養(yǎng)支持后12、24、48 h觀察大鼠腹腔內(nèi)各臟器的大體情況，進(jìn)行腹主動脈采血后處死。血液標(biāo)本室溫靜置30 min，然后在4℃下12 000 r/min速度離心約5 min后提取血清，血清于-20℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6 、IL-10水平，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.4.2各組腎功能指標(biāo) 保存于-20℃中的血清，采用全自動生化分析儀進(jìn)行血清淀粉酶(AMY)、血清血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)的測定。

1.4.3各組組織學(xué)指標(biāo) 取胰腺和腎臟組織，先用生理鹽水沖洗干凈，然后4%多聚甲醛固定24 h后，采用石蠟包埋后切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色處理，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變。采用改良的Schmidt等〔5〕病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，對大鼠胰腺組織的病理變化作定量評估和組織學(xué)研究。采用Rabb等〔6〕評分標(biāo)準(zhǔn)對各組腎臟組織進(jìn)行病理學(xué)評估，評估由兩位實(shí)驗(yàn)人員單獨(dú)進(jìn)行，取平均值作為最終評分。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1胰腺組織形態(tài)觀察 (1)SO組胰腺組織3個時間點(diǎn)無明顯變化，胰腺組織為淡粉紅色，光澤度較好，無明顯壞死和出血等病理改變；(2)SAP組：腹腔可見血性腹水，胰腺組織充血、水腫，且有散在出血點(diǎn)和部分壞死，隨時間的進(jìn)行而加重，表明造模成功。(3)EEN組和EIN組在不同時間點(diǎn)病變程度不同，都可見到胰腺組織光澤變暗、充血和水腫等病變，但腹水、出血和壞死的程度較SAP組明顯減輕。且EIN組較EEN組減輕。

2.2光鏡觀察病理改變

2.2.1各組胰腺組織病理變化 (1)SO組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，無出血壞死；(2)SAP組12 h胰腺組織結(jié)構(gòu)輕度紊亂，間質(zhì)水腫明顯，少量炎性細(xì)胞浸潤，少許腺泡細(xì)胞壞死；24 h胰腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，部分腺泡細(xì)胞壞死；48 h胰腺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，間質(zhì)充血、出血，大量炎性細(xì)胞浸潤，腺泡大面積壞死。(3)EEN組間質(zhì)水腫減輕，腺泡壞死減少，炎癥細(xì)胞浸潤程度較SAP組減輕。(4)EIN組彌漫性小葉間水腫、出血壞死灶及炎癥細(xì)胞浸潤較EEN組減輕。見圖1。

2.2.2各組腎臟組織病理變化 (1)SO組腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常。(2)SAP組腎組織可見明顯異常改變，12 h出現(xiàn)輕度腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小管管腔擴(kuò)張；24 h腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，部分腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，小管間血管充血；48 h腎小管上皮細(xì)胞重度水腫，管腔出血，間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞可見部分壞死。(3)EEN組較SAP組腎小管上皮腫脹程度、腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度減輕。(4)EIN組較EEN組間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度、腎小管上皮細(xì)胞充血水腫程度、上皮細(xì)胞壞死程度均減輕。見圖2。

2.2.3各組胰腺、腎臟組織病理評分 各組胰腺組織標(biāo)本根據(jù)Schmidt評分顯示：①各組胰腺病理評分有時間依賴性(均P<0.05)；②EEN、EIN組各時間點(diǎn)胰腺病理評分均明顯低于SAP組(P<0.05)；③EIN組各時間點(diǎn)胰腺組織病理評分均明顯低于EEN組(P<0.05)。各組腎臟組織標(biāo)本根據(jù)Schmidt評分顯示：①各組腎臟病理評分有時間依賴性(均P<0.05)；②EEN、EIN組各時間點(diǎn)腎臟病理評分明顯低于SAP組(P<0.05)；③EIN組各時間點(diǎn)腎臟組織病理評分明顯低于EEN組(P<0.05)，見表1。

2.3各組AMY、BUN、Cr水平比較 (1)AMY比較：①SO組AMY水平較低，各時間點(diǎn)無明顯變化，且各時間點(diǎn)均明顯低于其余3組(P>0.05)；②SAP組、EEN組及EIN組24 h AMY水平明顯高于12 h,48 h AMY水平明顯低于24 h(均P<0.05)；③SAP組、EEN組及EIN組同一時間點(diǎn)AMY水平比較：SAP組>EEN組>EIN組(均P<0.05)。(2)BUN、Cr水平比較：①SO組不同時間點(diǎn)BUN、Cr水平無顯著差異(P>0.05)；②各組同一時間點(diǎn)BUN、Cr水平比較:SAP組>EEN組>EIN組>SO組(P<0.05)；③SAP組、EEN組及EIN組BUN、Cr水平呈時間依賴性(均P<0.05)。見表2。

圖1 各組營養(yǎng)支持不同時間點(diǎn)胰腺組織病理變化(HE，×100)

圖2 各組營養(yǎng)支持不同時間點(diǎn)腎臟組織病理變化(HE，×100)

表1 各組營養(yǎng)支持不同時間點(diǎn)胰腺、腎臟組織病理學(xué)評分分)

2.4各組血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較 SO組血清TNF-α、IL-6和IL-10水平較低，在造模后各時間點(diǎn)無顯著差異(P>0.05)，且各時間點(diǎn)均明顯低于其余3組(P<0.05)；SAP組、EEN組及EIN組24 h TNF-α水平明顯高于12 h,48 h AMY水平明顯低于24 h(均P<0.05)；SAP組、EEN組及EIN組同一時間點(diǎn)TNF-α水平比較：SAP組>EEN組>EIN組(均P<0.05)；各組同一時間點(diǎn)IL-6水平比較:SAP組>EEN組>EIN組>SO組(P<0.05)，IL-10水平比較：SO組

表2 各組營養(yǎng)支持不同時間點(diǎn)血清AMY、BUN及Cr、TNF-α、IL-6、IL-10水平比較

3 討 論

由于SAP時機(jī)體處于強(qiáng)烈應(yīng)激狀態(tài)，微循環(huán)功能障礙，難以為機(jī)體提供正常的營養(yǎng)及能量供應(yīng)，可在較短時間內(nèi)引發(fā)細(xì)菌轉(zhuǎn)移及炎癥瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)，進(jìn)而發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(MODS)，對SAP相關(guān)腎損傷的發(fā)生起關(guān)鍵作用〔7〕。BUN主要經(jīng)腎小球?yàn)V過后由腎小管重吸收，當(dāng)腎損傷或處于全身炎癥反應(yīng)時，腎小球?yàn)V過降低，導(dǎo)致血清BUN表達(dá)水平顯著上升，從而反映腎損傷的程度和病情的嚴(yán)重程度〔8〕。正常情況下Cr主要通過尿液排出體外，當(dāng)腎臟功能受損導(dǎo)致對Cr濾過能力降低，從而引起血清Cr上升，可能發(fā)展為ARF〔9〕。本研究結(jié)果表明EIN聯(lián)合EEN能有效控制SAP的發(fā)展，減輕腎臟組織的進(jìn)一步損害?？赡茉駿IN中L-Arg能擴(kuò)張血管，有效改善胰腺微循環(huán)，抑制血小板黏附和聚集，有效抗血栓形成，改善機(jī)體的缺血狀態(tài)〔10〕。亦可參與機(jī)體蛋白代謝，抑制炎癥細(xì)胞因子的生成和胰酶的激活，從而對SAP胰腺本身及腎功能均有一定的保護(hù)作用。

細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的持續(xù)過量釋放是導(dǎo)致SAP持續(xù)發(fā)展并造成急性ARF的重要原因。由于SAP時機(jī)體微循環(huán)功能障礙，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞過度激活，釋放的大量TNF-α、IL-6等炎癥因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。TNF-α是反映SAP早期嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，可進(jìn)入血液促進(jìn)白細(xì)胞在炎癥局部聚集并活化，造成胰腺組織損傷和臟器功能紊亂。IL-6可激發(fā)白細(xì)胞黏附參與SIRS和MODS。IL-10通過抑制巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增殖與活化，從而減少炎癥因子釋放，在SAP治療及預(yù)防中起到修復(fù)胰腺損傷的關(guān)鍵作用〔11〕。本研究結(jié)果表明EIN聯(lián)合EEN能下調(diào)TNF-α、IL-6促炎細(xì)胞因子的釋放，有效調(diào)節(jié)IL-10抗炎因子產(chǎn)生，從而恢復(fù)體內(nèi)抗炎因子與促炎因子之間的平衡，對SAP腎損傷起到治療作用。鄭傳明等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)大量的炎性因子如TNF-α、IL-6 及IL-1β瀑布樣釋放導(dǎo)致腎臟損傷和加重微循環(huán)障礙，同時也是造成高死亡率的主要原因。EIN中谷氨酰胺是機(jī)體內(nèi)最豐富的條件非必需氨基酸，是多種免疫細(xì)胞的主要能源物質(zhì)，提示可能Gln刺激免疫細(xì)胞分泌，調(diào)節(jié)生成細(xì)胞因子，能抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌，可顯著減輕SAP時機(jī)體炎癥，從而保護(hù)組織器官功能。此外EIN營養(yǎng)液中特有的三聯(lián)活菌片，皆為健康人腸道正常菌群，可在人體腸道中生長繁殖，可抑制并清除腸致病菌對腸上皮細(xì)胞的黏附，避免其繁殖，減少腸內(nèi)菌群的移位，促進(jìn)腸蠕動及穩(wěn)定腸黏膜免疫屏障，從而減少或阻斷炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，有效預(yù)防SAP并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。