長鏈非編碼RNA NEAT1在急性缺血性腦卒中的診斷價值

鄭海建 王翎 劉廣嵐 潘旭東

(1連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 連云港 222100；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科)

急性缺血性腦卒中(AIS)占全部腦卒中的60%～85%，是腦卒中最常見的一種類型，AIS的發(fā)病機制是一個多環(huán)節(jié)、多因素、多機制的惡性級聯(lián)過程，其中腦缺血再灌注損傷(I/R)及其炎癥反應(yīng)是引起神經(jīng)損傷的重要因素。目前AIS的診斷主要依靠神經(jīng)影像技術(shù)，但由于昂貴的成本和侵襲性并不適合所有患者〔1〕，因此，探索無創(chuàng)高敏感性生物標(biāo)志物用于AIS的早期診斷至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA核富集豐富的轉(zhuǎn)錄本(LncRNA NEAT)1與許多細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子相互作用，在心、腦血管病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在I/R過程中表達(dá)上調(diào)，LncRNA NEAT1能通過誘導(dǎo)凋亡途徑直接相關(guān)的下游因子而造成細(xì)胞損傷，參與腦卒中的病理過程〔2〕。本研究分析LncRNA NEAT1在AIS中的診斷價值，可以為該病的診斷及預(yù)后評估提供理論參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 病例組：選自2019年8月至2020年4月就診于連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的AIS患者83例(AIS組)，其中男46例、女37例，年齡在40～90歲；入組標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病72 h內(nèi)；②患者診斷均符合中國急性缺血性腦卒中診治指南(2014)診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕，而且經(jīng)頭顱CT或磁共振成像(MRI)檢查發(fā)現(xiàn)相對應(yīng)的責(zé)任病灶；③MRI證實AIS。排除標(biāo)準(zhǔn):①既往腦卒中病史；②存在急性炎癥、腫瘤、嚴(yán)重心臟、肝、腎及血液系統(tǒng)疾?。虎凼中g(shù)及外傷史；④彌漫性肌肉疾病史；⑤自身免疫性疾病。對照組(NC組)：選取同期就診于醫(yī)院門診體檢者40例，其中男19例、女21例，年齡40～90歲。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：體格檢查中無腦血管病證據(jù)和(或)頭顱MRI/CT檢測正常者，排除患嚴(yán)重肝、腎疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病。

1.2標(biāo)本采集與檢測 受試者均隔夜禁食12 h，于清晨安靜狀態(tài)下留取空腹靜脈血5 ml，標(biāo)本用無菌試管留取，枸櫞酸鈉抗凝。室溫放置2 h后，以5 000 r/min離心10 min后，分離血漿，取血漿凍存于-80℃冰箱待檢。5 ml注入生化專用的試管，分離血清，西門子ADvia2400全自動生化分析儀檢測生化指標(biāo)，包括空腹血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。檢測條件符合實驗室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果可靠。

1.3血漿LncRNA NEAT1及IL-8測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測血漿LncRNA NEAT1表達(dá)，試劑盒由美國Applied Biosystems公司提供，檢測儀型號ABI-7300；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿白細(xì)胞介素(IL)-8；試劑盒由上海富勒生物科技有限公司提供，所有操作按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.4觀察項目、指標(biāo)、評價標(biāo)準(zhǔn) 神經(jīng)功能缺損評分用美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS)評定〔4〕。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗、Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)分布資料采用Spearman非參數(shù)統(tǒng)計分析。用受試者工作特征(ROC)曲線評估血漿LncRNA NEAT1對AIS的診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般特征及AIS危險因素比較 兩組比較性別、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史、TC、LDL-C、GLU差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O.05)。兩組年齡、TG、HDL-C、IL-8比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2兩組血漿LncRNA NEAT1比較 AIS組血漿LncRNA NEAT1表達(dá)量高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 兩組的基本信息比較

2.3AIS組血漿LncRNA NEAT1與NIHSS及一般資料的相關(guān)性 血漿LncRNA NEAT1與NIHSS (r=0.460，P=0.000)、IL-8(r=0.324，P=0.003)呈正相關(guān)，與年齡(r=0.168，P=0.130)、TC(r=0.038，P=0.734)、TG(r=-0.120，P=0.280)、LDL(r=0.109，P=0.325)、HDL-C(r=-0.065，P=0.559)、GLU(r=-0.011，P=0.918)均無顯著相關(guān)性。

2.4ROC曲線分析 LncRNA NEAT1對AIS患者的診斷價值較大，最佳診斷界值為0.019，約登指數(shù)為0.486，ROC曲線下面積(AUC)為0.747，95%CI為0.657～0.837。

3 討 論

AIS主要是由于頸動脈或椎動脈血栓栓塞而導(dǎo)致血流突然中斷或減少，血氧及營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足神經(jīng)細(xì)胞正常功能需求，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的缺血、壞死，進(jìn)而引起神經(jīng)功能障礙的臨床癥狀綜合征。AIS的病理生理過程復(fù)雜，I/R在缺血性腦血管病急性期的各個環(huán)節(jié)中起著重要作用。再灌注對于缺血性腦組織恢復(fù)正常功能是必不可少的，但它可能導(dǎo)致繼發(fā)性損傷；由于腦缺血恢復(fù)血液再灌注后，包括再灌注時氧自由基爆發(fā)、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等一系列級聯(lián)反應(yīng)使得神經(jīng)損傷和功能障礙反而進(jìn)一步加重；首先，腦缺血后早期再灌注損傷可加重缺血程度而導(dǎo)致二次缺血損傷的病理生化級聯(lián)反應(yīng)〔5〕。其次，在腦缺血發(fā)作后幾分鐘到幾小時內(nèi)，常駐細(xì)胞的激活會引發(fā)一系列炎癥事件。而炎癥帶來的腦繼發(fā)性損傷的治療時間窗較動脈閉塞后的原發(fā)性損傷更長〔6〕。第三，腦I/R損傷的發(fā)病機制中氧化應(yīng)激起重要作用。由于氧自由基過量產(chǎn)生引起的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)核因子(NF)-κB信號通路激活，導(dǎo)致促炎癥因子釋放〔IL-8，IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α〕，從而導(dǎo)致血腦屏障破壞和血管性水腫而加重腦卒中的臨床癥狀〔7〕。

LncRNA NEAT1是心腦血管疾病病理過程中的關(guān)鍵因素。I/R損傷小鼠模型中觀察到LncRNA NEAT1對心肌炎性反應(yīng)有促進(jìn)作用，并用抑制LncRNA NEAT1可敲低動脈粥樣硬化相關(guān)事件〔8〕。針對I/R損傷小鼠模型中研究表明，LncRNA NEAT1促進(jìn)氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥損害，并能增強血管內(nèi)膜的厚度或血管閉塞后通過調(diào)節(jié)血管平滑的表型轉(zhuǎn)化使細(xì)胞過度凋亡，參與AIS的病理過程，表明LncRNA NEAT1可能是AIS診斷和治療靶標(biāo)〔2〕。本研究結(jié)果表明AIS患者體內(nèi)血漿中LncRNA NEAT1表達(dá)明顯增加，此指標(biāo)的高表達(dá)參與了AIS的發(fā)生和發(fā)展。且LncRNA NEAT1對AIS的診斷有一定的準(zhǔn)確性，其診斷效能中等。

LncRNA NEAT1高表達(dá)可增加AIS嚴(yán)重程度，LncRNA NEAT1高表達(dá)可能會增強腦微循環(huán)功能障礙，通過調(diào)節(jié)β-catenin信號通路，導(dǎo)致正常腦血管發(fā)生生理、病理性改變，從而增加疾病的嚴(yán)重程度；并且lncRNA NEAT1還可通過促進(jìn)內(nèi)膜增厚或血管閉塞調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化及上皮細(xì)胞過度凋亡，從而增強動脈粥樣硬化病變并加重AIS的嚴(yán)重程度〔9〕；本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AIS患者血漿LncRNA NEAT1的表達(dá)與NIHSS評分呈顯著正相關(guān)，表明LncRNA NEAT1的表達(dá)量可以用于AIS病情嚴(yán)重程度的預(yù)測或判斷，其表達(dá)量越高，疾病的嚴(yán)重程度越重。

NEATl可作為脯氨酸/谷氨酰胺富集剪切因子負(fù)性調(diào)節(jié)因子使炎癥因子如IL-8表達(dá)增加，從而在炎癥反應(yīng)中起重要的作用，在AIS的炎癥反應(yīng)中，報道最多的細(xì)胞因子是TNF-α、IL-10、IL-8、IL-20和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β，其中IL-8和TNF-α可加劇腦損傷，而TGF-β和IL-10 卻可能有神經(jīng)保護作用，促炎癥因子的增加與低水平抗炎癥因子都會引起更大的壞死區(qū)和嚴(yán)重的臨床后果〔10〕。本研究提示LncRNA NEAT1與AIS的炎癥水平和病情進(jìn)展有關(guān)。LncRNA NEAT1高表達(dá)可能會加速疾病的發(fā)展，它可通過調(diào)節(jié)并促進(jìn)炎癥反應(yīng)而定位一些靶基因或途徑在腦卒中的發(fā)生、發(fā)展中起作用。國內(nèi)有研究報道〔11〕老年動脈硬化性腦卒中患者早期主要是發(fā)生促炎反應(yīng)，隨著梗死時間的延長，人體通過誘導(dǎo)大量外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制促炎因子的表達(dá)，抑制過度的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡。

綜上所述，血漿LncRNA NEAT1對AIS有一定的早期診斷價值，診斷效能較好，可作為一種新型生物標(biāo)志物，有助于判斷疾病的炎癥水平及嚴(yán)重程度。