葡聚糖結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及檢測深部真菌感染的應(yīng)用

朱李茹，黃友明，章宏祥，周發(fā)友，唐曉磊*

(1.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部, 湖北 襄陽 441021;2.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心, 安徽 蕪湖 241000)

內(nèi)源性和外源性的真菌侵襲并突破了機(jī)體的皮膚黏膜屏障，從而導(dǎo)致了深部臟器的感染統(tǒng)稱為侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)，其發(fā)生概率呈上升趨勢[1-2]。其主要原因大致為危險(xiǎn)因素的增加和患者免疫力的低下，如腫瘤放化療患者、人類免疫缺陷病毒感染群體、先天性免疫功能不全者等。抗生素的不規(guī)范使用也大大增加了侵襲性真菌感染的概率，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的真菌感染尤為兇險(xiǎn)[3-4]，且其診斷較為困難[5]。

臨床通常以臨床癥狀結(jié)合影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查為手段對其進(jìn)行鑒別。最早實(shí)驗(yàn)室IFI檢查手段，如真菌培養(yǎng)、涂片查找真菌病原體以及通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)查找；在2009年首次報(bào)道了PCR技術(shù)檢測真菌的實(shí)驗(yàn)性研究[6]。但迄今真菌病原體的檢出周期及檢出率均不能滿足臨床的需求；此外，血清相關(guān)抗體的檢查并不能夠完全反映機(jī)體屆時(shí)的感染狀態(tài)。因此非培養(yǎng)的快速診斷實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)對IFI診斷更有意義。針對臨床真菌類型，其標(biāo)志物主要分為兩類：酵母型真菌感染標(biāo)志物[如：抗甘露聚糖抗體、抗酵母菌芽管抗體、核酸檢測及(1,3)-β-D-葡聚糖檢測]和曲霉菌感染標(biāo)志物[如：半乳甘露聚糖、曲霉菌流式檢測、曲霉菌核酸檢測及(1,3)-β-D-葡聚糖檢測]。因此，對真菌特異性抗原的檢測臨床主要以G試驗(yàn)為主[7]。然而飲食、藥物、醫(yī)療操作以及標(biāo)本質(zhì)量均會對G-Test法檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的影響[8]。

鑒于以上所述，本研究通過基因克隆手段獲得美洲鱟來源的葡聚糖結(jié)合蛋白(glucans binding protein, GBP)的葡聚糖結(jié)合活性片段，并以其為(1,3)-β-D-葡聚糖特異性配基，從而實(shí)現(xiàn)對臨床體液標(biāo)本中(1,3)-β-D-葡聚糖的定量[9]。旨在能夠通過免疫學(xué)手段，克服其他外界因素對(1,3)-β-D-葡聚糖檢測的影響，從而完成IFI輔助診斷。

1 材料與方法

1.1 研究對象和材料

1.1.1 研究對象: 篩選皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2017年2月至2019年10月期間IFI患者和健康體檢人員各48名。清晨空腹用促凝管抽全血4 mL，3 500 r/min離心15 min收獲血清，冷凍于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。侵襲性真菌感染患者納入標(biāo)準(zhǔn)：1)近期有放化療、激素類藥物應(yīng)用、侵入性治療史、免疫抑制劑應(yīng)用史，且伴有高熱、寒戰(zhàn)等顯著感染癥狀；2)真菌培養(yǎng)和/或涂片呈陽性；3)G試驗(yàn)陽性4)白介素6(IL-6)或降鈣素原(procalcitonin，PCT)至少1項(xiàng)陽性。符合上述任意3項(xiàng)者，臨床確診為侵襲性真菌感染[10]。本研究納入48例IFI成年患者(男/女=15/9、年齡分布為29～73歲)，其中36例來源于呼吸系統(tǒng)患者，9例來源于腫瘤放化療患者；3例來源于燒傷患者。

1.1.2 試劑:pET30a-GBP252-668質(zhì)粒合成于上海生物工程公司；大腸桿菌BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；(1,3)-β-D-葡聚糖(Elicityl公司)；抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體(北京中杉金橋生物公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑盒、無蛋白封閉液、TMB顯色液和終止液(濟(jì)南泰天和生物公司)；Ni-agarose純化柱(QIAGEN公司)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒和卡那霉素(kanamycin,Kan)(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白分子質(zhì)量marker和DNA梯度marker[賽默飛科技(中國)有限公司]；苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑cocktail,異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)(阿拉丁生化科技股份有限公司)；其余化學(xué)試劑(國藥化工集團(tuán)公司)。

1.2 方法

1.2.1 GBP252-668表達(dá)質(zhì)粒的鑒定： 根據(jù)質(zhì)粒信息，使用NedⅠ和HindⅢ雙限制性快速內(nèi)切酶對pET30a-GBP252-668酶切進(jìn)行鑒定，總反應(yīng)體積20 mL，體系如下：pET30a-GBP252-668質(zhì)粒10 mL，NedⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶各1 mL，10×緩沖液2 mL，dd H2O 6 mL；于37 ℃水浴10 min，95 ℃ 5 min加熱終止反應(yīng)，行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。同時(shí)將pET30a-GBP252-668質(zhì)粒行測序鑒定。

1.2.2 GBP252-668蛋白的表達(dá)及純化： 將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，42 ℃水浴90 s熱沖擊，通過卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性LB固體培養(yǎng)基篩選并挑取陽性單克隆接種于液體LB培養(yǎng)基5 h后，加入IPTG濃度0.8 mmol/L,25 ℃ 誘導(dǎo)過夜；10 000×g，離心15 min獲得菌體，預(yù)冷無菌PBS洗滌菌體2次，離心收集菌體。-80 ℃凍融2～3次，加入溶菌酶至終濃度10 mg/mL，4 ℃過夜, 超聲裂菌10 min。4 ℃ 10 000×g離心30 min收集上清，行SDS-PAGE分離后考馬斯亮蘭染色鑒定。將裂解的上清與Ni-NAT純化柱置于4 ℃混勻器上連續(xù)混勻2 h，期間加入苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)和蛋白酶抑制劑Cocktail。結(jié)合后的Ni-NAT純化柱依次分別使用咪唑緩沖液(含咪唑濃度20、30、50、80、200 mmol/L)進(jìn)行洗滌、洗脫。洗脫液再次經(jīng)SDS-PAGE分離后行考馬斯亮蘭染色鑒定。

1.2.3 GBP雙夾心法的體系構(gòu)建: 將獲得的高純度GBP252-668蛋白精確定量后行辣根過氧化物酶標(biāo)記。以不同濃度的GBP包被和不同濃度的GBP-HRP進(jìn)行檢測。以含10% DMSO的PBS溶液為陰性對照；將(1,3)-β-D-葡聚糖用含10%二甲基亞砜磷酸鹽緩沖液稀釋至200 ng/L作為陽性對照。將測得的包被濃度(coatingconcentration, CC)和檢測濃度(detection concentration, DC)構(gòu)建的GBP252-668雙夾心法用于人血清基質(zhì)的檢測，即以健康人血清作為陰性標(biāo)本，以加入終濃度200 ng/L(1,3)-β-D-葡聚糖的健康人血清作為陽性標(biāo)本，作6個(gè)復(fù)孔，驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所建立的方法學(xué)的檢測效能。

1.2.4 兩種方法臨床檢測效能比對: 將96份人血清標(biāo)本分別行GBP252-668雙夾心法檢測和G-Test檢測。GBP252-668雙夾心法同時(shí)設(shè)置5個(gè)濃度梯度：0、50、100、200和400 ng/L，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。并對雙夾心法與G-Test法測得的(1,3)-β-D-葡聚糖結(jié)果使用ROC曲線分析其檢測效能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GBP表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET30a-GBP252-668雙酶切產(chǎn)物，兩條條帶分別依次位于1 000 bp與2 000 bp之間以及5 000 bp與6 000 bp之間，與插入目的基因大小(1 251 bp)和pET30a載體片段(5 422 bp)大小相符，見圖1。測序結(jié)果與Genbank (編號為：NM_001314167.1)比對完全一致，無錯(cuò)配、突變。

1.plasmid pET30a-GBP252-668; 2.plasmid pET30a-GBP252-668 was digested by restriction enzyme Ned Ⅰ and Hind Ⅲ; M.DNA marker圖1 GBP重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-GBP252-668的雙酶切鑒定Fig 1 Identification of recombinant plasmid pET30a- GBP252-668 using restriction enzyme digestion

2.2 重組GBP252-668蛋白的表達(dá)及純化

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在分子質(zhì)量40 ku與50 ku之間有一條顯著高表達(dá)蛋白條帶，與預(yù)測重組目的蛋白分子質(zhì)量46 774(約46.77 ku)相符(圖2)；經(jīng)Ni-agarose純化，獲得了純度較高的重組GBP蛋白(圖3)；經(jīng)由抗-His標(biāo)簽單克隆抗體檢測，在40 ku與50 ku之間有條帶(圖4)。

M.protein marker; 0.the E.coli BL21 containning recombinant plasmid pET30a-GBP252-668 was induced without IPTG; 1.the E.coli BL21 containning recombinant plasmid pET30a-GBP252-668 was induced with IPTG at 25 ℃ for 16 hours; 2.the E.coli BL21 containning recombinant plasmid pET30a-GBP252-668 was induced with IPTG at 37 ℃ for 16 hours; arrow indicated the recombinant target protein圖2 SDS-PAGE分析重組GBP252-668蛋白的表達(dá)Fig 2 Analysis of recombinant GBP252-668 protein expression by SDS-PAGE

M.protein marker; 1.the supernatant of lysis bacteria with IPTG-induced at 25 ℃ for 16 hours; 2.the residual from lysis bacteria with IPTG-induced was affinity by Ni-agarose; 3, 4, 5, 6 and 7.the supernatant of Ni-agarose were washed with different concentrations of imidazole buffer in turn, 20, 30, 50, 80, and 200 mmol/L; arrow indicated the recombinant target protein圖3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純化的重組GBP252-668蛋白Fig 3 Analysis of purified recombinant GBP252-668 protein by SDS-PAGE

圖4 免疫印跡法分析純化的重組GBP252-668蛋白Fig 4 Analysis of purified recombinant GBP252-668 protein by Western blot

2.3 GBP雙夾心法體系的構(gòu)建

棋盤法顯示，其最佳包被GBP濃度和HRP標(biāo)記的GBP工作液分別為 0.8 g/L和1.6 g/L(表1)；該方法對以人血清作為基質(zhì)的陰性標(biāo)本和陽性標(biāo)本進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)顯示其陽性標(biāo)本與陰性標(biāo)本吸光度值(absorbance,A)比值約為7，能夠顯著區(qū)分陰性與陽性(圖5)。

2.4 兩種方法的臨床檢測效能比對

通過制定標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合算法，對待測標(biāo)本中的(1, 3)-β-D-葡聚糖定量分析(圖6)；納入48名IFI患者和48名健康人作為待測對象(表2)；兩種方法檢測結(jié)果使用ROC曲線進(jìn)行擬合，算得GBP雙夾心法其靈敏度(sensitivity)和特異度(specificity)分別為91.67%(95%CI:80.02%～97.68%)和89.58%(95%CI:77.34%～96.53%)；G試驗(yàn)的敏感性和特異性分別為91.67%(95%CI:80.02%～97.68%) 和79.17%(95%CI:65.01%～89.53%)；GBP雙夾心法ROC曲線面積為0.9282(95%CI:0.8679～0.9884)；G試驗(yàn)的ROC曲線面積為0.9128(95%CI:0.8548～0.9695)(圖7)。

3 討論

近年來，臨床深部真菌感染日益嚴(yán)重，真菌培養(yǎng)、涂片是IFI的實(shí)驗(yàn)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但由于周期較長且標(biāo)本的獲取不易或容易污染，因此以(1,3)-β-D-葡聚糖為標(biāo)志物的G-Test目前應(yīng)用更為廣泛[11-13]。眾所周知，(1,3)-β-D-葡聚糖是絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要骨架成分(新型隱球菌屬、毛口菌屬除外)，隨著真菌的分裂生長及機(jī)體吞噬細(xì)胞的吞噬消化，其骨架成分被釋放入血，對外周血中(1,3)-β-D-葡聚糖檢測可以作為深部真菌感染的輔助診斷指標(biāo)。目前G-Test法通過動(dòng)態(tài)濁度的變化推算(1,3)-β-D-葡聚糖含量。而這一級聯(lián)催化過程以及待測標(biāo)本的質(zhì)量嚴(yán)重影響檢測結(jié)果。鑒于G-Test檢測手段的不足，本研究通過克隆表達(dá)(1,3)-β-D-葡聚糖的特異性配基——GBP252-668蛋白，利用該配基與靶標(biāo)(1,3)-β-D-葡聚糖的特異性識別與結(jié)合能力進(jìn)行血清學(xué)檢測，以評估機(jī)體侵襲性真菌感染狀況。葡聚糖結(jié)合蛋白(GBP)為一類能夠特異性結(jié)合葡聚糖的蛋白的統(tǒng)稱。有研究表明不同物種來源的GBP能夠高效識別并結(jié)合不同結(jié)構(gòu)的葡聚糖[14]。在我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，美洲鱟的GBP較之其他物種的GBP顯示出較高的結(jié)合力。分析美洲鱟來源的GBP mRNA編碼668個(gè)氨基酸肽鏈，其包含3個(gè)區(qū)域：第1位氨基酸到第20號氨基酸為信號肽；第27位氨基酸到第253號氨基酸為葡聚糖水解酶活性片段；第252位氨基酸到第668號氨基酸為葡聚糖活性結(jié)合片段。因此本研究純化獲得了重組GBP252-668 蛋白并構(gòu)建雙GBP夾心法檢測系統(tǒng)，其具有高檢測靈敏度、寬線性范圍等特點(diǎn)。

表1 棋盤法確立雙GBP夾心法的包被和檢測試劑工作濃度Table 1 Concentrations of GBP for coating and detection were established by chessboard method

表2 納入研究對象的96名人員的基本信息比較Table 2 Comparison of basic information from 96 donors in this research

*P<0.01 compared with blank control圖5 構(gòu)建的GBP雙夾心法對血清基質(zhì)中(1,3)-β-D-葡聚糖的分析Fig 5 Analysis of (1,3)-β-D-glucans in serum matrix

圖6 GBP雙夾心法測定血清 (1,3)-β-D-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 6 Stander curve of (1,3)-β-D-glucans in serum using GBP sandwich method n=6)

圖7 兩種方法對96例血清(1,3)-β-D-葡聚糖檢測效能的ROC曲線Fig 7 ROC of two methods for (1,3)-β-D-glucans detection efficiency n=96)

本研究使用該方法和G-Test法對臨床血清標(biāo)本進(jìn)行檢測的性能比對，結(jié)果顯示兩種方法的靈敏度較為一致，而夾心法特異度高于臨床現(xiàn)行的G-Test法。分析可能原因如下[8]：1)原理：夾心法的特異性優(yōu)于級聯(lián)催化法；2)血清標(biāo)本的質(zhì)量對夾心法影響較小；3)特定結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)物質(zhì)使配基法檢測更為特異；4)本次探索的夾心法操作步驟簡單，極大減少了操作過程中的誤差。

(1,3)-β-D-葡聚糖作為目前深部真菌感染公認(rèn)的標(biāo)志物，其在臨床確診前提前5～10 d檢測出陽性[15-16]，且當(dāng)病情惡化為嚴(yán)重膿毒癥時(shí)，這一過程中該標(biāo)志物的水平會持續(xù)升高。這一現(xiàn)象提示了對(1,3)-β-D-葡聚糖的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，或可用于監(jiān)測臨床深部真菌感染的治療效果。而本次研究所入選研究對象均為嚴(yán)重深部真菌感染的患者，其病程長短不一，因此本次無法精確評估該系統(tǒng)預(yù)測真菌感染的價(jià)值。本方法檢測的入選研究對象(IFI患者和健康體檢者)，其靈敏度和特異度分別為91.67%(95%CI:80.02%～97.68%)和89.58%(95%CI:77.34%～96.53%)，ROC曲線面積為0.9282(95%CI:0.8679～0.9884)。特異度高于本次檢測的G-Test法。同比國外學(xué)者報(bào)道的G-Test法，均有所增高[17]。

綜上所述，本研究初步實(shí)現(xiàn)了通過分子克隆技術(shù)模擬美洲鱟體內(nèi)天然存在的特異性葡聚糖識別配基，并驗(yàn)證該重組配基具有識別、結(jié)合(1,3)-β-D-葡聚糖的能力，并應(yīng)用于臨床標(biāo)本檢測。本次實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建檢測方法，有望開發(fā)為一種新型的侵襲性真菌感染的檢測試劑盒，進(jìn)而為臨床IFI鑒別診斷提供數(shù)據(jù)支持。