外周血miR-200c水平對(duì)移植異基因造血干細(xì)胞后急性移植物抗宿主病發(fā)生的預(yù)測(cè)作用

武 坤，聶 波，李云濤，楊金榮，程沈菊，李艷紅，史明霞*

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科; 2.血液科，云南 昆明 650032)

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoi-etic stem cell transplantation，allo-HSCT)是利用供者持久而穩(wěn)定的細(xì)胞移植體發(fā)揮抗疾病效應(yīng)，移植成功后受者造血及免疫功能改善，處于嵌合狀態(tài)時(shí)能夠維系終身[1-2]。急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)是allo-HSCT常見并發(fā)癥，臨床治療雖有多種方案，但是效果欠佳，盡快找到評(píng)估aGVHD發(fā)生的因子對(duì)早期改善疾病具有重要幫助[3]。

隨著生物分子靶向研究不斷深入，微小RNA已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。miR-200c基因簇定位于12號(hào)染色體p13.31，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，例如在乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤中水平下調(diào)，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為[4]。文獻(xiàn)證實(shí)，腎移植大鼠體外實(shí)驗(yàn)研究表明被轉(zhuǎn)化因子激活的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA-ATB)能夠通過上調(diào)miR-200c表達(dá)而降低移植后急性排斥反應(yīng)，其研究機(jī)制與抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號(hào)通路相關(guān)[5]。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014年1月至2018年10月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科行allo-HSCT的51例患者作為研究對(duì)象，男性33例，女性18例，年齡10～47歲，中位年齡36歲。根據(jù)移植后是否發(fā)生aGVHD原則分為實(shí)驗(yàn)組(發(fā)生aGVHD)33例，對(duì)照組(未發(fā)生aGVHD)18例，所有患者或家屬均知曉本文研究?jī)?nèi)容，自愿簽署知情同意書[倫理號(hào)：(2021)倫審L條10號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理方案：全相合移植患者采用改良白消安+環(huán)磷酰胺(BUCY)為預(yù)處理方案；采用環(huán)孢素+甲氨蝶呤預(yù)防aGVHD。半相合移植患者采用依托泊苷+白舒非+環(huán)磷酞胺+抗胸腺細(xì)胞球蛋白為預(yù)處理方案；采用環(huán)孢素+嗎替麥考酚酯+甲氨蝶呤預(yù)防aGVHD。

1.2.2 aGVHD治療方案：當(dāng)患者發(fā)生aGVHD時(shí)，立即給予甲波尼龍1～2 mg/(kg·d)，同時(shí)將環(huán)孢素調(diào)整至初始劑量，給藥5 d后觀察療效，無效者加用巴利昔單抗、他克莫司等二線治療。

1.2.3 miR-200c引物的設(shè)計(jì)與合成：引物序列由上海生工設(shè)計(jì)并合成，目的基因：miR-200c引物上游:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6引物上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游:5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 RT-qPCR 檢測(cè)患者外周血中miR-200c相對(duì)表達(dá)：抽取患者肘部外周血5 mL置入加有抗凝劑的離心管中，離心力2 054×g、離心10 min，分離血清，-80 ℃低溫保存。使用ReverTraAceqPCR RTKit返轉(zhuǎn)錄試劑盒定量檢測(cè)RNA。反應(yīng)體系為15 μL，5 μL RNA模板，3 μL miR特異型莖環(huán)引物及U6進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min，60 ℃退火60 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)40次，每個(gè)循環(huán)后收集1次熒光，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，連續(xù)檢測(cè)熒光后進(jìn)行產(chǎn)物分析。用2-ΔΔCt的方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者均移植成功，且恢復(fù)造血功能，恢復(fù)時(shí)間為18 d，其中33例出現(xiàn)aGVHD，發(fā)生率為64.71%，兩組性別、移植年齡分布、疾病類型、預(yù)處理方案、移植情況和供受者性別比較無差異(表1)。

2.2 RT-qPCR檢測(cè)兩組移植前后不同時(shí)間點(diǎn)miR-200c表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組在移植前、移植后7、14、及72 d 時(shí)miR-200c表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，在移植后28 d時(shí)兩組無差異(表2)。

2.3 aGVHD發(fā)生前后miR-200c表達(dá)

對(duì)33例aGVHD發(fā)生后外周血中miR-200c為(2.23±0.25)顯著低于發(fā)生前的(1.02±0.10)(P<0.001)。

表1 一般資料比較Table 1 Comparison of general data[n(%)]

表2 兩組移植前后不同時(shí)間點(diǎn)miR-200c表達(dá)Table 2 Expression of miR-200c at different time points before and after transplantation in the two groups

2.4 不同aGVHD嚴(yán)重程度的miR-200c表達(dá)

與aGVHD Ⅰ度相比，Ⅱ度aGVHD患者外周血中miR-200c表達(dá)下調(diào)(P<0.001)，與Ⅱ度相比，aGVHD Ⅲ度患者外周血中miR-200c表達(dá)下調(diào)(P<0.001)(圖1)。

*P<0.001 compared with aGVHD Ⅰ degree; #P<0.05 compared with aGVHD Ⅱ degree圖1 不同aGVHD嚴(yán)重程度的miR-200c表達(dá)Fig 1 miR-200c expression in different aGVHD severity levels

2.5 miR-200c對(duì)aGVHD疾病的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

移植28 d時(shí)，miR-200c ROC曲線下面積為0.850，敏感性為84.50%，特異型為81.2%，AUC=0.785，95%CI：0.669～0.837，Cutoff值為：0.93(P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-200c對(duì)aGVHD的預(yù)測(cè)Fig 2 Prediction of aGVHD by miR-200c

2.6 生存分析

33例移植后28 d時(shí)發(fā)生aGVHD患者miR-200c水平為0.95±0.04，以均值(0.95)為基線，<0.95視為miR-200c低表達(dá)(19例)，≥0.95視為miR-200c高表達(dá)(14例)，對(duì)發(fā)生aGVHD所有患者隨訪2年，高表達(dá)組2年總生存率為71.43%(10例)，低表達(dá)組2年總生存率為50%(7例)，高表達(dá)組患者2年總生存率高于低表達(dá)組，組間比較存在差距(P<0.05)(圖3)。

圖3 兩組患者2年生存率分析Fig 3 2-year survival rate analysis of patients in the two groups

3 討論

aGVHD是allo-HSCT移植后100 d內(nèi)發(fā)生的排斥反應(yīng)，發(fā)生原因可能與移植患者進(jìn)行強(qiáng)效預(yù)處理而導(dǎo)致消化道系統(tǒng)及皮膚黏膜排斥反應(yīng)有關(guān)[6]。aGVHD發(fā)生的重要機(jī)制是供者移植物中T細(xì)胞對(duì)受試者主要及次要組織相容性抗原的差異識(shí)別發(fā)揮在抗原遞呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)作用[7]。部分學(xué)者提出miR在供者T細(xì)胞攻擊宿主過程中可能存在潛在的破壞靶細(xì)胞作用[8]。本文證實(shí)，aGVHD發(fā)病者外周血中miR-200c表達(dá)下調(diào)。miR-200c在腎移植動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)下調(diào)，通過靶向調(diào)節(jié)其表達(dá)水平能夠發(fā)揮抗急性排除作用，miR-200c能夠通過下調(diào)TLR4信號(hào)改善免疫排除[9]。在器官移植患者中采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)急性排斥患者TLR4表達(dá)上調(diào)，miR-200c 能夠抑制移植者血清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)，阻斷核因子(NF-kB)活性減少急性排除時(shí)發(fā)生的炎性反應(yīng)。

十八屆歐洲血液學(xué)會(huì)上證實(shí)allo-HSCT移植后發(fā)生aGVHD疾病患者血液中多個(gè)miR出現(xiàn)表達(dá)異常，例如miR-146a等在其中呈現(xiàn)高表達(dá)，miR-3168呈現(xiàn)低表達(dá)[10]。本研究表明miR-200c在aGVHD發(fā)生后表達(dá)量低于未發(fā)生aGVHD疾病，推測(cè)miR-200c水平改變與移植者造血系統(tǒng)重建、供者T淋巴細(xì)胞攻擊受者組織發(fā)生大量炎性反應(yīng)誘導(dǎo)aGVHD發(fā)生有關(guān)。aGVHD患者當(dāng)伴隨機(jī)體感染時(shí)機(jī)體血清炎性因子表達(dá)上調(diào)，并隨著aGVHD嚴(yán)重程度而升高，說明miR-200c具有通過調(diào)節(jié)炎性信號(hào)通過而降低免疫排斥，降低aGVHD疾病程度[11]。

對(duì)白血病及淋巴瘤患者進(jìn)行allo-HSCT移植后患者發(fā)生aGVHD疾病，采用臨床化學(xué)療法治療后復(fù)發(fā)率仍較高。對(duì)allo-HSCT移植后aGVHD患者5年生存率進(jìn)行分析，高表達(dá)miR-155a GVHD患者生存率顯著低于低表達(dá)者[12]。本文研究aGVHD復(fù)發(fā)率高于未患有aGVHD者，ROC曲線分析顯示miR-200c診斷效能較強(qiáng)。miR-200c對(duì)肝癌患者臨床敏感性及特異性較高，但也與miR-200c不同亞型、檢測(cè)方法及樣本量存在相關(guān)性。miR-200c在血液腫瘤及aGVHD疾病的診斷相關(guān)文獻(xiàn)尚未報(bào)道，但對(duì)異基因造血干細(xì)胞移植后急性移植物抗宿主病有一定預(yù)測(cè)作用[13-14]。

綜上所述：miR-200c水平降低與異基因造血干細(xì)胞移植后aGVHD的發(fā)生相關(guān)，隨著aGVHD嚴(yán)重程度升高其表達(dá)水平降低，miR-200c低表達(dá)患者生存率較差，說明外周血中檢測(cè)miR-200c可作為早期診斷和預(yù)測(cè)aGVHD的生物標(biāo)志物。