小續(xù)命湯對腦出血小鼠腦組織中線粒體凋亡和自噬的影響*

河北中醫(yī)學院

郭亞凈 任 靜 劉 寒 吉恩生△(石家莊 050200)

提要 目的：探討小續(xù)命湯對腦出血(ICH)小鼠腦組織中線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡和自噬的作用及機制。方法：健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組(n=12)：假手術(shù)組、ICH組、小續(xù)命湯治療組、小續(xù)命湯對照組。向ICH組和小續(xù)命湯治療組小鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)注入30 μL自體非抗凝血，建立ICH模型。假手術(shù)組和小續(xù)命湯對照組采用同樣的操作過程，但不注入血液。模型建立后，小續(xù)命湯治療組和小續(xù)命湯對照組給予小續(xù)命湯水煎液，連續(xù)灌胃1周后，收集腦組織標本。原位末端標記法(TUNEL)用于觀察細胞凋亡情況；免疫組織化學檢測用于觀察線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)和線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、微管相關(guān)輕鏈蛋白3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Parkin、PINK-1的表達情況；Western blot用于檢測Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)、NF-κB和p-NF-κB蛋白的表達情況。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，ICH組TUNEL結(jié)果顯示小鼠血腫周圍腦組織中TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著增多(P<0.001)，免疫組織化學檢測結(jié)果顯示Bax、cleaved-caspase-3、PINK-1表達顯著上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2和Bcl-2/Bax比值顯著下降(P<0.01)，Western blot結(jié)果顯示TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組TUNEL結(jié)果顯示血腫周圍腦組織中TUNEL陽性細胞的數(shù)量顯著減少(P<0.01)，免疫組織化學檢測結(jié)果顯示Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-2/Bax比值、Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK-1表達水平顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.001)。Western blot結(jié)果顯示TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：小續(xù)命湯通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制ICH小鼠腦組織中的線粒體凋亡并促進線粒體自噬。

腦出血(ICH)指腦實質(zhì)內(nèi)的非創(chuàng)傷性出血，屬于中醫(yī)“中風”范疇。ICH約占腦血管疾病的15%，具有較高的病死率和致殘率，僅40%的幸存者可恢復(fù)正常[1]。ICH的不良預(yù)后歸因于血腫及其對大腦的機械壓迫所引起的原發(fā)性腦損傷和隨即出現(xiàn)的繼發(fā)性腦損傷[2]。然而，手術(shù)清除血腫不能顯著改善患者的預(yù)后，且缺乏有效改善繼發(fā)性腦損傷的醫(yī)療手段[3-4]。

小續(xù)命湯在現(xiàn)代臨床應(yīng)用中治療急性缺血性中風及后遺癥療效顯著[5-6]。并且，小續(xù)命湯可以改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損，減輕缺血性損傷[7]。然而，小續(xù)命湯在改善ICH后遺癥，縮短急性期療程方面也具有一定的優(yōu)勢。老中醫(yī)高允旺善用小續(xù)命湯治療急性ICH昏迷不醒，認為小續(xù)命湯為“治療ICH的金方”[5]。有證據(jù)表明，小續(xù)命湯可以抑制線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡和自噬，從而改善ICH再灌注損傷[8-10]。并且，越來越多的臨床和臨床前證據(jù)表明，凋亡和自噬參與了ICH的病理生理過程[6, 11]。

本研究利用自體血注射小鼠ICH模型，研究小續(xù)命湯對ICH后血腫周圍腦組織中線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡和自噬的影響。

1 材料

1.1 動物 C57BL/6小鼠48只，8～10周齡，體質(zhì)量約20～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：CSXK[京]2016-0006。本實驗經(jīng)河北中醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準，編號DWLL20200068。

1.2 藥物與制劑 小續(xù)命湯由麻黃、防己、人參、黃芩、桂心、甘草、芍藥、川芎、杏仁、附子各9 g，防風12 g，生姜6 g組成，所用中藥均購于河北中醫(yī)學院國醫(yī)堂，經(jīng)河北中醫(yī)學院中藥教研室鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定。將麻黃用2 L蒸餾水浸泡30 min后加熱，沸騰3次，去沫，然后將其余中藥放入水中，加熱至沸騰，繼續(xù)微沸煎煮至剩600 mL煎液，過濾煎液后再加1 L蒸餾水，煎煮至剩600 mL煎液，過濾。合并2次過濾后的煎液，加熱濃縮至含生藥質(zhì)量濃度為1.62 g/mL的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 原位末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒(中國Servicebio公司，貨號GDP1042)；通用SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號SP-9002)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZLI-9017)；RIPA裂解液(中國Servicebio公司，貨號G2002)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國Servicebio公司，貨號G2026)；Bcl-2抗體(中國Boster公司，貨號BA0412)；Bax抗體(中國Affinity公司，貨號AF0120)；活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)抗體(美國CST公司，貨號14220)；Beclin-1抗體(中國Biogot公司，貨號AP0768)；微管相關(guān)輕鏈蛋白3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)抗體(中國Affinity公司，貨號AF4650)；Parkin抗體(中國Boster公司，貨號PB9307)；PINK-1抗體(中國Affinity公司，貨號DF7742)；Toll樣受體4(TLR4)抗體(中國Servicebio公司，貨號GB11519)；髓樣分化因子88(MyD88)抗體(中國Boster公司，貨號BA2321)；NF-κB抗體(中國Affinity公司，貨號AF5006)；p-NF-κB抗體(中國Affinity公司，貨號AF2006)；β-actin抗體(中國Servicebio公司，貨號GB11001)；山羊抗兔IgG(中國Servicebio公司，貨號G1213)；ECL化學發(fā)光試劑盒(中國Servicebio公司，貨號G2014)。

1.4 主要設(shè)備 全自動腦立體定位儀(51700，stoelting公司，美國)；烘箱(UF160，MEMMERT公司，德國)；正置熒光顯微鏡(DM5000B，Leica公司，德國)；酶標儀(Varioskan LUX，Thermo Fisher公司，美國)；電泳儀(PowerPac Universal，Bio-Rad公司，美國)；半干轉(zhuǎn)印槽(Trans-BLot Smidry，Bio-Rad公司，美國)；多功能成像系統(tǒng)(Fusion FX5 Spectra，Vilber Lourmat，法國)。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立方法 將C57BL/6小鼠隨機分為4組(n=12)：假手術(shù)組、ICH組、小續(xù)命湯治療組、小續(xù)命湯對照組。參考相關(guān)文獻，建立ICH模型[12]。ICH組和小續(xù)命湯治療組小鼠，1%戊巴比妥鈉100 μL/g腹腔注射麻醉。待小鼠徹底麻醉后，將其固定于全自動腦立體定位儀上。剪去頭頂毛發(fā)，碘伏消毒，剪開頭部正中皮膚約0.5 cm，定位前囟，然后以前囟作為原點，向前0.5 mm，向右旁開2.3 mm，標記為穿刺點。用顱鉆垂直向下鉆開直徑約1 mm的小孔。剪斷尾尖，取30 μL自體非抗凝血至微量注射器中，用微量注射泵將微量注射器向下推進3.7 mm穿刺進入紋狀體，以2 μL/min的速度注入血液，注射結(jié)束后停留5 min，緩慢退針。骨蠟封閉小孔，縫合切口。假手術(shù)組和小續(xù)命湯對照組釆用同樣的麻醉及手術(shù)操作過程，但不注入血液。模型建立后，根據(jù)《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》計算出小鼠給藥劑量為16.2 g/(kg·d-1)。小續(xù)命湯治療組和小續(xù)命湯對照組給予小續(xù)命湯，假手術(shù)組和ICH組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃1周。

2.2 取材方法 給藥結(jié)束后，小鼠用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行灌流，將血管內(nèi)的血液沖洗干凈。完整取出腦組織，去除小腦和腦干，僅留大腦。以血液注射進針點冠狀面為基準，分別向其前后延伸0.5 mm距離，切取厚約1 mm的腦組織，放入4%組織細胞固定液進行固定，隨后進行蠟塊包埋和切片，用于病理學檢測；用于Western blot檢測的腦組織僅留取患側(cè)紋狀體，液氮中存放24 h后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱備用。

2.3 原位末端標記法(TUNEL)染色 石蠟切片脫蠟至水后，用蛋白酶K進行修復(fù)。然后將玻片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加破膜工作，常溫下孵育20 min。PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加buffer，常溫孵育10 min后滴加反應(yīng)液(TDT酶、dUTP和buffer按1∶5∶50比例混合)，放于濕盒內(nèi)，37 ℃恒溫箱孵育2 h。切片用PBS(pH7.4)洗滌3次，每次5 min。滴加DAPI復(fù)染細胞核，避光室溫孵育10 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干，用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，用ImageJ軟件分析TUNEL陽性細胞數(shù)量。

2.4 免疫組織化學 石蠟切片脫蠟至水后，切片置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液中進行微波抗原修復(fù)。切片室溫冷卻后于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。然后，滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。在切片上滴加3% BSA，室溫封閉15 min。輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS(pH7.4)按一定比例配好的一抗，置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。第2 d，將玻片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。然后復(fù)染細胞核，脫水、透明后中性樹膠封片。切片于倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，用ImageJ軟件分析。

2.5 Western blot 紋狀體腦組織內(nèi)按一定比例加入RIPA裂解液提取蛋白。離心后，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。將上清與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按1∶4比例混勻后，于100 ℃進行蛋白變性5 min。隨后，將制備好的樣本進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和脫脂奶粉封閉，TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB和β-actin抗體用TBST按一定比例稀釋后，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次15 min。孵育HRP標記的二抗后，用ECL化學發(fā)光試劑盒來檢測蛋白表達。采用Image J軟件進行灰度值分析。以目的蛋白與β-actin灰度比值表示各目的蛋白的相對表達量。用于觀察腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達及激活情況。

3 結(jié)果

3.1 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TUNEL陽性細胞數(shù)量的影響 與假手術(shù)組比較，ICH組小鼠腦組織TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著增加(P<0.001)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)。見圖1。

注：A.假手術(shù)組；B.ICH組；C.小續(xù)命湯治療組；D.小續(xù)命湯對照組(圖2～圖4同)；與假手術(shù)組比較，*** P<0.001；與ICH組比較，## P<0.01。圖1 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中凋亡細胞數(shù)量的影響(TUNEL，×400)

3.2 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，ICH組小鼠腦組織中Bcl-2和Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01)，Bax和cleaved-caspase-3顯著升高(P<0.05)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中Bcl-2和Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)，Bax和cleaved-caspase-3顯著降低(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

表1 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

3.3 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，ICH組小鼠腦組織中PINK1表達顯著升高(P<0.05)，而Beclin-1、LC3-Ⅱ和Parkin表達雖有升高，但差異無顯著性(P>0.05)；小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1表達均顯著升高(P<0.05，P<0.001)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中Parkin和PINK1表達顯著升高(P<0.05)，Beclin-1和LC3-Ⅱ表達雖有升高，但差異無顯著性(P﹥0.05)。見圖3、表2。

圖3 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

表2 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表達的影響

3.4 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，ICH組小鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見圖4、表3。

圖4 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達的影響

表3 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白相對表達水平的影響

4 討論

小續(xù)命湯為唐代治療中風第一要方。由于對中風病機的認識由“外風”轉(zhuǎn)變?yōu)椤皟?nèi)風”，小續(xù)命湯在金元及其后期逐漸不被主流醫(yī)家認可。隨著國家對中醫(yī)藥傳承工作的重視，古代經(jīng)典名方的臨床價值再次受到醫(yī)家及學者們的關(guān)注，小續(xù)命湯也被重新提及。

中風包括現(xiàn)代醫(yī)學中的腦梗死、ICH、短暫性腦缺血發(fā)作等腦血管疾病。小續(xù)命湯可以提高中風恢復(fù)期患者的生活能力，改善其生活質(zhì)量[13-14]。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，小續(xù)命湯聯(lián)合西醫(yī)治療可以縮小ICH病人的血腫體積，減輕患者神經(jīng)損傷、肢體功能障礙等后遺癥[15-17]。實驗研究顯示，小續(xù)命湯可以縮小ICH大鼠的血腫體積，改善局部腦血流、降低脂質(zhì)過氧化物的活性，阻止細胞外Ca2+內(nèi)流以控制、減輕腦水腫[18-19]。然而，小續(xù)命湯發(fā)揮ICH治療作用的機制有待進一步研究。

細胞凋亡參與多種腦血管疾病的病理過程，與ICH后血腫周圍組織的神經(jīng)元丟失密切相關(guān)[6]?？沟蛲龅鞍譈cl-2表達減少或促凋亡蛋白Bax表達增多均可導(dǎo)致細胞凋亡增強。Bcl-2/Bax比值穩(wěn)定在一定水平，可維持膜電位，防止線粒體凋亡途經(jīng)重要信號蛋白細胞色素C釋放入細胞質(zhì)中而引起凋亡。Cleaved-caspase-3則是細胞凋亡進入不可逆階段的標志。研究發(fā)現(xiàn)，小續(xù)命湯有效成分可以升高慢性腦缺血大鼠腦組織中的線粒體膜電位，減少細胞色素C釋放，升高Bcl-2/Bax比值，抑制caspase誘導(dǎo)的下游級聯(lián)，從而減輕神經(jīng)元凋亡[8, 20]。筆者的研究結(jié)果顯示，小續(xù)命湯顯著減少了ICH小鼠血腫周圍TUNEL陽性細胞的數(shù)量，增加了腦組織中Bcl-2的表達和Bcl-2/Bax比值，降低了Bax和cleaved-caspase-3的表達。結(jié)果表明，小續(xù)命湯抑制了ICH小鼠血腫周圍組織的細胞凋亡。

自噬與ICH病人和實驗動物的神經(jīng)元損傷相關(guān)，抑制線粒體自噬可以減輕ICH后的繼發(fā)性腦損傷[21]。Beclin-1是自噬引發(fā)階段的關(guān)鍵調(diào)控因子[22]。當線粒體受到去極化刺激后，觸發(fā)PINK1/Parkin通路調(diào)控的線粒體自噬，泛素化的線粒體蛋白與LC3-Ⅱ共同形成自噬小體[23]。Lan等發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯通過下調(diào)自噬基因LC3、Beclin-1、Lamp1和線粒體P62的表達來抑制線粒體自噬，對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用[10]。而筆者的研究結(jié)果顯示，小續(xù)命湯顯著增加了ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1表達。結(jié)果表明，小續(xù)命湯促進ICH小鼠血腫周圍腦組織中的線粒體自噬。筆者推測這種相反的研究結(jié)果，可能與ICH后不同時間段的病理生理特征有關(guān)，此時增強線粒體自噬，可以通過清除老化的胞內(nèi)細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，保護細胞免受缺血和缺氧等刺激。

TLR4被激活后可以通過MyD88依賴和非依賴兩條途徑激活NF-κB，從而產(chǎn)生生物學效應(yīng)[24]。抑制或阻斷TLR4/MyD88/NF-κB通路，可以使胞漿中細胞色素C水平升高，線粒體中細胞色素C水平降低，降低cleaved-caspase-3表達，從而抑制細胞的線粒體凋亡[25-26]。并且，抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路，也可以抑制線粒體自噬[27]。吳海洋等研究發(fā)現(xiàn)，小續(xù)命湯聯(lián)合超早期針刺督脈可以顯著改善腦缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)功能缺損情況并抑制自噬相關(guān)蛋白NF-κB p65活性，保護腦功能[28]。另外，體外和在體實驗均顯示，小續(xù)命湯可以降低小膠質(zhì)細胞TLR4和MyD88的表達[29]。同樣，筆者的研究結(jié)果顯示，小續(xù)命湯降低了ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB 和p-NF-κB的表達。

綜上所述，小續(xù)命湯抑制了ICH小鼠血腫周圍腦組織中的細胞凋亡，促進了線粒體自噬，這可能與其對TLR4/MyD88/NF-κB通路的調(diào)控作用相關(guān)。進一步完善了小續(xù)命湯治療ICH的作用機制。