應(yīng)用基因芯片技術(shù)探討載脂蛋白E基因多態(tài)性與冠心病的嚴(yán)重程度與預(yù)后關(guān)系

黃健中，劉文東，楊曉蘭，陳惠茹

（廣東省東莞市濱海灣中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 東莞 523900）

0 引言

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，心血管病危險(xiǎn)因素對居民健康的影響越加顯著，心血管病發(fā)病率仍持續(xù)增高。目前，中國心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為46.66%，城市為43.81%，心血管病給居民和社會帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日漸加重[1]。推算中國CVD現(xiàn)患病人數(shù) 3.3 億，其中冠心病1139萬，2018 年中國城市居民冠心病死亡率為 120.18/10萬，農(nóng)村居民冠心病死亡率為128.24/10萬[2]。其中血脂異常是冠心病主要危險(xiǎn)因素，載脂蛋白 E（ApoE）基因是與血脂相關(guān)的基因之一[3]。其編碼的異構(gòu)體與受體的親和性以及代謝速率影響個體間血脂水平，在脂類代謝及維持膽固醇平衡等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時(shí)直接參與動脈粥樣硬化、心肌梗死的病理生理過程[4]。目前ApoE基因多態(tài)性研究多集中在血脂水平、降脂療效等方面，對冠心病的嚴(yán)重程度研究較少。本研究旨在探討冠心病患者ApoE的基因多態(tài)性與冠脈病變程度的關(guān)系。為冠心病的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

入選標(biāo)準(zhǔn)：202例病例樣本來自2019年7月-2020年7月期間，在東莞市濱海灣中心醫(yī)院心內(nèi)科住院確診冠心病患者，均行冠脈造影術(shù)，結(jié)果顯示至少1支冠狀動脈或其主支狹窄超過50%。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重的肝、腎功能損害；②內(nèi)分泌功能障礙；③甲狀腺疾??；④嚴(yán)重高血壓未受控制；⑤未控制的糖尿病；⑥腎病綜合征或腎功能不全；⑦妊娠或準(zhǔn)備懷孕的婦女，哺乳期婦女；⑧過敏體質(zhì)及急性炎癥期患者。

1.2 研究對象一般資料及臨床資料

所有研究對象采集年齡、性別、體重、身高、高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史及冠心病家族史等資料。并隨訪6個月，內(nèi)容包括心絞痛及心肌梗死再發(fā)、心力衰竭等。高血壓診斷符合2005年《中國高血壓防治指南》，收縮壓≥140mmHg，或舒張壓≥90mmHg；以休息15min后，3次坐位右上臂血壓平均值為血壓值。糖尿病診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 血液樣本采集與測定

所有研究對象在空腹8小時(shí)后次日早晨抽采外周靜脈血6mL。3mL置于EDTA管中，送中心實(shí)驗(yàn)室行檢測基因型。3mL送化驗(yàn)室應(yīng)用全自動生化分析儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、CREA。

1.4 GRACE 評分

入院后進(jìn)行急性冠狀動脈事件全球注冊（GRACE）風(fēng)險(xiǎn)評估，評分指標(biāo)包括：年齡，入院心率，收縮壓，血清肌酐，入院時(shí)是否有心臟驟停，ST段抬高，肌鈣蛋白I升高，及心力衰竭。

1.5 基因檢測及主要儀器、試劑

所采靜脈血分離血清后用基因分型芯片法測定ApoE基因并分型。主要儀器及試劑：ApoE基因分型芯片法檢測試劑盒（珠海賽樂奇生物）；PCR擴(kuò)增儀（ABI2720）；基因芯片閱讀儀（Sinochips-PGA，珠海賽樂奇生物技術(shù)）。

1.6 基因分型

基因芯片可檢測出6種ApoE基因表型，即E2/2、E2/3、E3/3、E2/4、E3/4、E4/4。ApoE蛋白有3種表現(xiàn)型，E2表型包括E2/2、E2/3，E3表型包括E3/3、E2/4，E4表型包括E3/4、E4/4。本實(shí)驗(yàn)主要以3種表現(xiàn)型分組作比較。

1.7 隨訪

通過電話和門診的方式隨訪出院6個月的主要不良心血管事件（MACE）。MACE主要包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性左心衰、非致死性心肌梗死、靶血管重建、心臟性猝死。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；所有計(jì)量資料采用均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；三組間計(jì)量資料采用ANVOA法分析比較。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 基因頻率的分布

202名冠心病患者中ApoE基因型分布如下：E2/2型2例，E2/3型35例，E3/3型136例，E2/4型5例，E3/4型22例，E4/4型2例。各基因表型基因頻率分布如下：E2/2型為0.99%，E2/3型為17.32%，E3/3型為67.33%，E2/4型為2.48%，E3/4型為10.89%，E4/4型為0.99%（見表1）。故ApoE2表型37例，ApoE3表型141例，ApoE4表型24例。

表1 ApoE基因表型分布

2.2 一般情況

3組間的TC、TG、LDL-C、HDL-C、CREA無顯著性差異；3組間的BMI、性別、家族史，以及高血壓病、糖尿病的患病率等無顯著性差異。在LDL-C水平上比較，E4組高于E2組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。

2.3 Grace評分及出院6個月的MACE

3組間的比較中，入院時(shí)Grace評分無差異；組間比較，E4與E2組相比，E4組分值高于E2組。隨訪6個月后，各組間MACE事件差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 各基因組合臨床資料比較

表3 各基因組合冠脈嚴(yán)重程度及預(yù)后對比

3 討論

ApoE基因?qū)儆诔Ｈ旧w顯性基因，具有顯著的遺傳多態(tài)性，包含3個等位基因（E2、E3、E4），進(jìn)而產(chǎn)生6種基因型：3種純合子（E2/E2、E3/E3、E4/E4），3種雜合子（E2/E3、E2/E4、E3/E4）和3種異構(gòu)體ApoE2（E2/E2和E2/E3）[5]。目前關(guān)于ApoE基因多態(tài)性研究多為其余血脂代謝間的研究，如部分研究表明，與E2型組相比，E3、E4型組TC、LDL-C明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；與E3型組相比，E2型、E4型組TG升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[6]。本研究結(jié)果顯示ApoE4型冠心病患者LDL-C水平明顯高于E2組冠心病患者。這是由于ApoE異構(gòu)體與LDL受體結(jié)合能力不同。ApoE2與LDL受體結(jié)合能力最低,導(dǎo)致TG水平升高；而ApoE4與LDL受體的結(jié)合能力較強(qiáng),導(dǎo)致TC和LDL水平升高,而對TG水平影響不大[7]。部分研究結(jié)果顯示，E4型冠心病患者TC和LDL水平最高。提示E4型則可能會加劇冠心病的發(fā)生、發(fā)展[8]。于淼等研究發(fā)現(xiàn)，通過與對照組相比，急性冠脈綜合征組E4等位基因頻發(fā)高于對照組，AopE4組冠狀動脈Syntax評分>32分的比例明顯高于ApoE2、ApoE3組，ApoE4組冠脈Syntax評分<22分的比例明顯低于ApoE2、ApoE3，可見含有ApoE4異構(gòu)體的急性冠脈綜合征病人冠狀動脈病變嚴(yán)重者所占比例較大[9]。提示冠脈嚴(yán)重程度與ApoE基因多態(tài)性存在相關(guān)性。有學(xué)者針對不同ApoE基因型冠心病患者支架植入術(shù)后隨訪，通過單因素分析結(jié)果顯示支架內(nèi)再狹窄組LDL-C水平顯著高于非支架再狹窄組，且E3/4基因型患者血清LDL-C水平亦明顯升高，二元Logistic回歸分析顯示支架內(nèi)再狹窄組與非支架內(nèi)再狹窄組組間LDL-C水平、E3/4基因頻率有顯著差異，是支架內(nèi)再狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對支架內(nèi)再狹窄組有較好的診斷價(jià)值，E3/4基因型患者支架內(nèi)再狹窄組風(fēng)險(xiǎn)增加2.4倍。這進(jìn)一步表明ApoE基因多態(tài)性可通過影響患者的血脂代謝而進(jìn)一步影響支架內(nèi)再狹窄組的發(fā)生。提示冠心病預(yù)后與ApoE基因多態(tài)性存在一定關(guān)系[10]。夏經(jīng)鋼等探討了急性冠脈綜合征患者中ApoE基因多態(tài)性與危險(xiǎn)分層和預(yù)后的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)與E2組相比，E4組GRACE評分顯著增多，隨訪1個月的MACE顯著增加[11]。本研究也初步探討了冠心病患者不同ApoE基因型與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系。從本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在入院時(shí)Grace評分對比中，E4組高于E2組，符合上述研究結(jié)果；但各組間MACE無明顯差異。目前，暫沒有大樣本、多中心、長時(shí)間的關(guān)于ApoE基因多態(tài)性與冠心病嚴(yán)重程度及預(yù)后關(guān)系的研究。本研究的入選人群為冠心病患者，包括急性冠脈綜合征及穩(wěn)定性冠心病患者，存在冠脈病變相對穩(wěn)定的患者，預(yù)后可能較急性冠脈綜合征患者好?？紤]上述研究與本研究均為單中心實(shí)驗(yàn)，對象不全相同；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)對象例數(shù)相對有限，隨訪時(shí)間較短，一定程度上局限了研究結(jié)論。