鮑溫樣丘疹病患者組織中PPAR-γ、COX-2的表達情況及其相關(guān)性分析

王麗兵,王亞斐,徐海豐,楊悅漪,王心妹,楊惠君

(秦皇島市第一醫(yī)院 皮膚科,河北 秦皇島 066000)

鮑溫樣丘疹病(Bowenold papulosis，BP)多發(fā)于青壯年人群，好發(fā)部位為股陰部，主要由于高危型人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)16與18感染所引起的。該病是一種非常常見的皮膚癌前病變，組織病理學表現(xiàn)為上皮棘層細胞出現(xiàn)一定的異型性改變，采取及時有效的診斷對該病的精準治療有重要意義。臨床研究顯示：過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(Peroxisome proliferators activate receptors -γ，PPAR-γ)活性被激活之后，不僅能夠?qū)δ[瘤細胞的增殖起到抑制作用，且會引起惡性腫瘤發(fā)生凋亡反應(yīng)[1-2]。還有研究表明：環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)作為前列腺素合成過程中的一種重要的限速酶，其參與了多種腫瘤的進展過程[3]。本研究采用免疫組化法，對組織中PPAR-γ、COX-2的臨床表達情況及其相關(guān)性進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年1月至2021年11月期間秦皇島市第一醫(yī)院皮膚性病科活檢的45例外陰病變皮膚組織作為觀察組，年齡最小為24歲，最大為58歲，平均(35.56±10.02)歲。另外選擇同期于醫(yī)院接受檢查的40例正常外陰病變皮膚組織作為對照組，年齡最小為23歲，最大為55歲，平均(34.98±9.88)歲。觀察組與對照組基礎(chǔ)資料差異均無顯著的統(tǒng)計學意義。

1.2 研究方法

1.2.1試劑 奧維亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的兔抗人PPAR-γ多克隆抗體與兔抗人COX-2多克隆抗體。

1.2.2SP法 (1)石蠟切片、脫蠟。切片按照順序經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，時間均為15 min。然后按照濃度梯度，分別使用濃度為100%、95%、85%及75%的乙醇脫水處理，每種濃度脫水時間1 min。最后使用蒸餾水對切片進行沖洗數(shù)次。(2)為了將H2O2酶的活性加以消除，使用濃度為3%的H2O2于室溫條件下避光孵育20 min。(3)再使用蒸餾水沖洗數(shù)次，并使用PBS溶液浸泡切片5 min。(4)使用微波爐對浸于枸緣酸鈉抗原修復溶液中的切片微波5 min，于室溫條件下自然冷卻。(5)使用蒸餾水進行沖洗，然后再使用PBS溶液進行沖洗3次。(6)使用濃度為5%的山羊血清對切片組織加以封閉，37℃溫度條件下孵育20 min。然后將多余液體甩掉。(7)向上述切片組織中滴加入PPAR-γ與COX-2一抗工作液，并在4℃溫度條件下的冰箱中過夜保存。(8)再使用PBS溶液對其進行沖洗3次。(9)向其上滴加經(jīng)1%的BSA-PBS溶液稀釋的生物素對二抗進行標記，于37℃溫度下孵育0.5 h。(10)5 min之內(nèi)，使用PBS溶液沖洗3次，再向其中滴加堿性磷酸酶標記鏈親和素，并于37℃溫度條件下孵育0.5 h，反復使用PBS溶液進行沖洗數(shù)次。(11)分別加入AP-Red試劑盒A、B、C中各1滴蒸餾水，并滴加切片上面，于室溫條件下顯色，在顯微鏡下對反應(yīng)時間加以控制。(12)使用蘇木素對細胞核進行復染0.5 h，然后用自來水對其進行沖洗，烘箱中烘干，封片采用中性樹膠。

1.3 結(jié)果判斷

經(jīng)SP法染色，當PPAR-γ與COX-2呈陽性時，其顆粒顏色為紅色，當其呈陰性時，則呈淡藍色。按照呈現(xiàn)紅色的程度與面積，對結(jié)果加以判定。于400倍的顯微鏡視野下對顯色結(jié)果予以觀察，具體評分方法為[4-6]：根據(jù)PPAR-γ與COX-2陽性程度著色情況，分為無著色、淡紅色、紅色以及深紅色4種程度，分別對應(yīng)計分為0分、1分、2分及3分，陽性表達率分別為0、<10%、10%-50%及>50%。根據(jù)最終評分結(jié)果對陽性表達結(jié)果予以判定：(1)0-2分記為“-”；(2)2-4分記為“+”；(3)4-6分記為“++”。陰性對照采用PBS溶液代替一抗。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 BP與正常組織中PPAR-γ的表達情況對比

觀察組組織中PPAR-γ表達評分與陽性率均分別顯著高于對照組[分別為(1.03±0.34)分與17.50%](P均<0.05)，見表1。

表1 BP與正常組織中PPAR-γ的表達情況比較

2.2 BP與正常組織中COX-2的表達情況對比

觀察組組織中COX-2表達評分與陽性率分別為(2.49±0.65)分與71.11%，均分別顯著高于對照組[分別為(0.95±0.18)分與7.50%](P均<0.05)，見表2。

表2 BP與正常組織中COX-2的表達情況比較

2.3 PPAR-γ與COX-2在BP及正常組織中的相關(guān)性分析

PPAR-γ與COX-2在BP組織陽性表達呈正相關(guān)性(P<0.05)，但是在正常組織中的表達二者不呈相關(guān)性(P>0.05)，見表3、4。

表3 PPAR-γ與COX-2在BP組織中的相關(guān)性

表4 PPAR-γ與COX-2在正常組織中的相關(guān)性

3 討論

BP是一種發(fā)病部位位于生殖器的多發(fā)性斑丘疹，能夠自行消退，但病理組織學呈原位癌樣病變。

PPAR作為常見的核激素受體家族成員，其活性被激活之后，能夠產(chǎn)生一種特殊的敏感性，即能夠加快脂肪細胞分化、脂肪生成等，對調(diào)節(jié)機體血糖水平以及抑制炎性因子、保護心血管與抑制惡性腫瘤細胞增殖等，均具有十分重要的價值。PPAR-γ是PPAR常見的一種亞型，在組織中分布較廣泛，有研究證明[7]：PPAR-γ激動劑能夠影響腫瘤的形成，包括細胞分化、增殖、凋亡、和血管生成等。有國外研究證明在大腦等高脂肪環(huán)境中，PPAR-γ也可起到促進癌癥發(fā)展的作用，在小鼠皮膚癌模型中發(fā)現(xiàn)[8]，PPAR-γ被活化后會引起血管生成因子下降，與此同時血管生成抑制因子升高，導致不利于血管生成的環(huán)境、影響了腫瘤的生長。Han[9]等報道,PPAR- γ在宮頸癌中陽性表達率顯著高于正常宮頸組織。Howe等研究結(jié)果表明[10]：COX-2作為前列腺素合成過程中的一種較為重要的限速酶，參與了腫瘤的進展過程。具體機制可能為：①對腫瘤細胞生長及新生血管形成具有刺激作用、對腫瘤細胞凋亡過程具有抑制效果；②參與腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移等過程；③對花生四烯酸代謝產(chǎn)物產(chǎn)生催化作用，從而抑制局部免疫功能等[11]。

由本研究相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,BP組織與正常對照組組織中的PPAR-γ陽性表達率之比為66.67%與17.50%，前者顯著高于對照組。上述結(jié)果提示：HPV感染會誘發(fā)PPAR-γ的過度表達，表明PPAR-γ在由正常組織轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤過程中扮演著一定的角色。出現(xiàn)上述結(jié)果可能原因在于：HPV對機體產(chǎn)生感染作用后，會使得本來具有抑癌作用的PPAR-γ失去了監(jiān)測細胞正常生長的功能，促進了角質(zhì)形成細胞異常地向腫瘤樣增生。目前，關(guān)于BP組織中PPAR-γ表達水平方面的報道較少，所以尚需臨床進一步研究。本研究結(jié)果還顯示：BP組織中COX-2陽性表達率為71.11%，顯著高于正常對照組(P<0.05)，此結(jié)果提示機體受到HPV感染后，會誘發(fā)COX-2異常表達。具體機制可能為：HPV感染后會誘使感染細胞COX-2陽性表達率升高，進而對局部免疫功能產(chǎn)生抑制性效果。

通過線性分析，結(jié)果顯示：PPAR-γ與COX-2在BP組織陽性表達呈正相關(guān)性(P<0.05)，但是在正常組織中的表達二者不呈相關(guān)性(P>0.05)。目前，國內(nèi)外關(guān)于二者在BP組織中表達的相關(guān)性方面的報道少見。阿仙姑·哈斯木[12]等發(fā)現(xiàn)PPARγ和COX-2在CIN、宮頸癌中的高表達。COX-2能夠與PGs等生成15d-PGJ2等產(chǎn)物，其能夠與PPAR-γ天然結(jié)合，并對COXs產(chǎn)生抑制作用。由此可知，PPAR-γ可能作為COX-2的下游基因參與到腫瘤的進展過程之中。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，BP組織中PPAR-γ與COX-2陽性表達更具一致性，是否與HPV感染導致皮膚惡性腫瘤病變過程相關(guān)，尚待進一步證實。關(guān)于PPAR-γ與COX-2表達情況之間的相關(guān)性，不同的研究，其結(jié)果也有所差異。如：相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞、胎肝細胞以及HT-29結(jié)腸癌細胞中，PPAR-γ配體會對COX-2的表達產(chǎn)生抑制作用[13]。

綜上所述，BP組織中PPAR-γ、COX-2均呈過表達特點，且二者在BP組織中的表達情況呈正相關(guān)性。