一株神經(jīng)氨酸酶H275Y突變的甲型H1N1流感病毒全基因組序列特征分析

崔 薇，孫炳欣，李晨光，宋亞男，初 秋，隋天卓，孫 宇，王宇冰，喬鳳娟，張興國

(長春市疾病預防控制中心，吉林 長春 130033)

流感病毒屬于正粘病毒科，它是分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒。其中甲型流感病毒含有8個基因節(jié)段，分別編碼RNA聚合酶復合體(PB1、PB2及PA)，血凝素(haemagglutinin，HA)，NP核蛋白(NP)，神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)，M1基質蛋白，M2離子通道蛋白，非結構蛋白1(NS1)以及非結構蛋白2(NS2)等，每種蛋白在流感病毒感染、增殖、釋放、擴散及傳播過程中都行使不同的功能[1]。

2009年墨西哥、美國等地暴發(fā)的甲型H1N1流感，造成了全球疫情。經(jīng)分析，甲型H1N1流感病毒是一種由南美 H1N1禽流感病毒、人H3N2流感病毒、南美H1N1經(jīng)典豬流感病毒以及歐亞類禽 H1N1豬流感病毒4種不同宿主來源的流感病毒基因片段重配產生的新的流感病毒亞型，目前它已取代早前的季節(jié)性H1N1流感病毒，成為在人群中流行的主要亞型[2-4]。

長春市CDC通過流感監(jiān)測網(wǎng)絡，從2018-2020年度長春市甲型H1N1流感病毒核酸陽性樣本中分離到1株神經(jīng)氨酸酶H275Y突變株，通過對其進行全基因組序列分析，了解該毒株的遺傳進化特征和變異情況，為甲型H1N1流感病毒的耐藥監(jiān)測、防控和臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

對長春市CDC 2018-2020年度甲型H1N1流感病毒分離株進行神經(jīng)氨酸酶(NA)基因特征分析，從中篩選出一株神經(jīng)氨酸酶H275Y突變株A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)。

1.2 甲型H1N1流感病毒毒株核酸提取和NA基因擴增

用碩世病毒核酸快速提取試劑盒在自動核酸提取儀上提取流感病毒毒株RNA，將提取到的病毒RNA先反轉錄成cDNA，再用設計的引物進行神經(jīng)氨酸酶(NA)基因擴增，對PCR產物用毛細管電泳方法進行確認。

1.3 甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)基因序列測定及分析

神經(jīng)氨酸酶(NA)基因PCR產物送至上海生工生物工程公司進行基因測序和拼接。拼接后的序列經(jīng)NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫Blast比對確認為甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)基因序列。使用Mega6.0軟件進行NA蛋白重要位點氨基酸突變分析，篩選出甲型H1N1流感病毒A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)，為神經(jīng)氨酸酶H275Y突變株。

1.4 全基因組序列測定及分析

對A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)病毒株進行全基因組序列測定。參照NCBI和GISAID網(wǎng)站上提供的甲型H1N1序列，對其全基因組各節(jié)段分別進行系統(tǒng)進化分析。參照早期疫苗株A/California/07/2009和同期疫苗株A/Brisbane/02/2018，進行同源性和各節(jié)段中重要氨基酸位點變異情況分析。

2 結果

2.1 全基因組序列確定

通過全基因組序列測定，獲得8個節(jié)段的編碼序列：PB2：2 280 bp；PB1：2 274 bp；PA：2 151 bp； HA：1 701 bp；NP：1 497 bp；NA：1 410p； M：982 bp(其中M1為759 bp；M2為 294 bp)；NS：838 bp(其中NS1為 660 bp；NS2為366 bp)。序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站基因數(shù)據(jù)庫BLAST比對后，均提示為甲型H1N1流感病毒基因。

2.2 全基因組同源性分析結果

流感病毒A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1) 8個節(jié)段與早期疫苗A/California/07/2009相比，核苷酸的同源性為96.1%- 98.3%，氨基酸同源性為94.9%- 99.2%；與同期疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，核苷酸的同源性為98.8%-99.7%，氨基酸同源性為98.7%-100%，詳見表1。

表1 A/Jilin-Chaoyang /SWL112 /2019(H1)流感病毒與疫苗株同源性比較

2.3 HA、NA基因系統(tǒng)進化分析結果

從GenBank和GISAID上下載WHO推薦的2010-2017年疫苗株A/California/07/2009、2017-2019年疫苗株A/Michigan/45/2015、2019-2020年北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018、2020-2021年北半球疫苗株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)、國內代表株A/Shanghai- Jiading/SWL1970/2015、國內分離的第1株甲型H1N1流感毒株A/Sichuan/1/2009(H1N1)、耐藥參考株A/Texas/23/2012(H275Y)以及國內外部分地區(qū)不同年份的甲型H1N1流感全基因組序列，對本次研究的流感病毒A/Jilin-Chaoyang /SWL112/2019(H1)全基因組各節(jié)段進行系統(tǒng)進化分析。結果顯示，該病毒株基因組8個節(jié)段都與2020-2021年北半球疫苗株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)屬于同一進化簇，且HA基因在系統(tǒng)進化樹上屬于6B.1A5簇，NA基因在系統(tǒng)進化樹上也屬于6B.1A5簇，全基因組進化分析情況詳見圖1。

圖1 A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)的遺傳進化分析

2.4 氨基酸位點分析

2.4.1血凝素蛋白(HA)氨基酸位點分析

與早期的參考疫苗株A/California/07/2009相比，本次研究的A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)流感毒株HA蛋白發(fā)生了較大的變異。HA蛋白信號肽發(fā)生了A13T位點突變，由疏水性的丙氨酸(A)變異為極性的蘇氨酸(T)，可能影響信號肽的疏水性，進而影響 HA蛋白表達和定位。其HA蛋白(不計信號肽)共發(fā)生了23處突變，分別是R45K、A48S、S74R、P83S、S84N、D97N、N129D、S162N、K163Q、S164T、S183P、S185T、S203T、I216T、A256T、N260D、K283E、I295V、I321V、E374K、F415L、S451N、E499K。其中，S162N、K163Q、S164T 變異位點位于Sa抗原決定簇，S185T變異位點位于Sb抗原決定簇，S203T變異位點位于Ca抗原決定簇，S74R變異位點位于Cb抗原決定簇，共有6個氨基酸位點變異涉及到4個抗原決定簇。

而與同期疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，其HA蛋白(不計信號肽)僅發(fā)生7處突變，分別是G45K、A48S、N129D、N260D、A282P、V298I和F415L，且未涉及到HA抗原決定簇相關位點的變化。

經(jīng)分析還發(fā)現(xiàn)，A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)流感毒株HA蛋白潛在的糖基化位點有9處，分別為10NNS、11NST、23NVT、87NGT、162NQT、276NTT、287NTS、481NGT 和540NGS，與同期疫苗株A/Brisbane/02/2018一致。而相對于早期的疫苗株A/California/07/2009，增加了1處潛在的糖基化位點162NQT。

甲型H1N1流感病毒在宿主間的傳播主要取決于HA蛋白的受體特異性結合位點。位于HA蛋白頭部的受體結合位點由190螺旋(187-195)、220環(huán)(218-225)和130環(huán)(132-135) 3個結構域構成[5]。毒株A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)的受體結合位點以及口袋底部的重要氨基酸位點高度保守，仍為190螺旋(187-DQQSLYQNA-195位)、130環(huán)(132-VTAA-135位)、220環(huán)(218-PKVRDQEG-225位) 以及口袋底部的Y91、W150、H180和Y192。

2.4.2神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)和膜蛋白(M)氨基酸位點分析

與流感病毒耐藥相關的蛋白主要是離子通道蛋白(M2)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)。其中M2蛋白跨膜區(qū)出現(xiàn)L26F、V27A、A30T/V、S31N、G34E中的1個或以上的突變，就會導致金剛烷胺類藥物耐藥株的出現(xiàn)。經(jīng)分析，A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)流感毒株M2跨膜區(qū)的第31位氨基酸為天冬酰胺(N)，提示其對金剛烷胺類藥物耐藥。除此之外，與早期的參考疫苗株 A/California/07/2009相比，M2蛋白僅發(fā)生D21G突變。而與同期疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，M2蛋白僅出現(xiàn)H10P位點的突變。

M1上與毒力相關的位點139位仍為T，215位上仍為A，未發(fā)生變異。且M1與早期的參考疫苗株A/California/07/2009相比，發(fā)生了4處突變，分別是V80I、M192V、Q208K和K230R。與同期的參考疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，未出現(xiàn)突變。

NA蛋白與早期的參考疫苗株A/California/07/2009相比，共發(fā)生了24處變異，分別是V13I、I34V、L40I、N44S、Q51K、G77R、Q78L、V81A、I188T、N200S、V241I、N248D、V264I、N270K、H275Y、I314M、I321V、Y351F、N369K、N386K、D416N、K432E、N449D和T452I。而與同期的參考疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，NA僅有6處氨基酸位點變異，分別是T13I、Q51K、Q78L、H275Y、D416N和T452I。由于NA蛋白與神經(jīng)氨酸酶抑制劑作用位點相關的第275位氨基酸出現(xiàn)H275Y的突變，提示流感病毒A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)為奧司他韋耐藥株。

2.4.3其他蛋白氨基酸位點分析

甲型H1N1流感病毒的其他蛋白包括堿性聚合酶2(PB2)、堿性聚合酶1(PB1)、酸性聚合酶(PA)、核蛋白(NP)和非結構蛋白(NS)。其中聚合酶PB2、PB1和PA共同構成RNA聚合酶復合體，同時具有轉錄酶活性和核酸內切酶活性。而 RNA聚合酶復合體又與NP蛋白、病毒RNA共同構成病毒核糖核蛋白體復合物(vRNP)，參與流感病毒基因組的復制和轉錄[6]。本次研究的流感病毒PB2、PB1、PA和NP蛋白中影響病毒致病性的幾個關鍵位點均未發(fā)生改變，如PB2蛋白中仍為89V、158E[7]、590S、591R、627E[8]、701D[9]和714S[10-11]；PB1蛋白中的622G、709V以及PB1-F蛋白的66N也未發(fā)生改變[12]；PA蛋白中仍表現(xiàn)為36A、154E[13]、157T[14]、353K和638R[15]。NP蛋白中仍表現(xiàn)為148Y、355R和361R。非結構蛋白NS1中與病毒復制能力相關的69L、77L[16]和與病毒毒力有關的42S、92D、103F、106M[17]也未發(fā)生變化。各蛋白的氨基酸位點分別與早期疫苗株A/California/07/2009及同期疫苗株A/Brisbane/02/2018比對，變異情況詳見表2。

表2 A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)病毒株全基因組突變氨基酸位點變異情況

3 討論

通過對長春市2018-2020年度甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)基因特征進行分析，發(fā)現(xiàn)1株甲型H1N1流感病毒株A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)，其NA蛋白出現(xiàn)H275Y位點突變，提示此毒株為奧司他韋耐藥株。本研究對其全基因組8個節(jié)段的基因特征及重要的氨基酸位點進行分析，了解其抗原性、致病性及耐藥性。

甲型H1N1流感病毒的抗原性主要是針對其表面的HA和NA蛋白而言。一般認為，甲型H1N1流感病毒的HA蛋白內部有4個抗原決定簇[18]，分別是(不計信號肽)：Sa(124、153-157、159-164)、Sb(184-195)、Ca(137-142、166-170、203、221、235) 以及 Cb(70-75)，這44個氨基酸是與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的重要位點，因此突變可能使病毒逃避宿主免疫細胞的識別，引起流行。以上位點若出現(xiàn)4個以上氨基酸突變，且突變涉及到2個及以上抗原決定簇位點；或1個涉及到抗原決定簇，另1個涉及到受體結合位點，就可以認為是具有流行病學意義的抗原變異株[19-20]。本次研究的毒株，與早期的參考疫苗株A/California/07/2009相比，HA蛋白的S162N、K163Q、S164T變異位于Sa 抗原決定簇，S185T 變異位于Sb抗原決定簇，S203T變異位于Ca抗原決定簇，S74R變異位于Cb抗原決定簇，共有6個氨基酸位點變異涉及到4個抗原決定簇，出現(xiàn)了抗原漂移現(xiàn)象。而與同期疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，HA蛋白(不計信號肽)僅發(fā)生了7處突變，并未涉及到HA抗原決定簇相關位點的變化，說明同期的疫苗A/Brisbane/02/2018對此毒株具有一定的免疫保護效果。

而甲型H1N1流感病毒NA蛋白的抗原決定簇主要有7個氨基酸區(qū)域，分別是N端的第152位、198-200位、328-334位、337-344位、364-367位、369-399位和431-434位，除此之外，還有研究認為140-157位也是甲型H1N1流感病毒NA蛋白的抗原決定簇所在[21-22]。與之前WHO推薦的國際疫苗株A/California/07/2009相比，流感毒株A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)的NA蛋白的N200S、N369K、N386K、K432E位點的突變，位于抗原區(qū)和抗體結合位點。而與同期疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，NA蛋白發(fā)生了6處突變，分別是T13I、Q51K、Q78L、H275Y、D416N和T452I，但未涉及到NA抗原決定簇相關位點的變化。

甲型H1N1流感病毒的致病性與多種因素密切相關。HA蛋白裂解位點、受體結合位點，PB2、PB1、PA以及NS1上的一些重要位點的突變都會影響其致病性。通常甲型H1N1流感病毒的HA可水解成HA1和HA2兩個獨立的肽鏈，二者通過二硫鍵相連，流感病毒HA斷裂成HA1和HA2是具有感染性的先決條件。HA蛋白中HA1和HA2裂解位點的堿性氨基酸的數(shù)量直接影響HA蛋白對宿主細胞體內蛋白水解酶的敏感性，進而影響流感病毒的致病性[23]。流感病毒HA裂解位點氨基酸序列中如果含有多個堿性氨基酸，則表現(xiàn)為高致病性；如果只含有1個堿性氨基酸位點則表現(xiàn)為低致病性。而毒株A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)的HA蛋白裂解位點氨基酸序列為VPSIQSR↓GLFGAIA，只含有1個堿性氨基酸為精氨酸R，未出現(xiàn)多個堿性氨基酸(R、K、H)，因此，仍保持低致病性特征。

甲型H1N1流感病毒的HA1蛋白第222位氨基酸位點突變也被證實與病毒致病性密切相關[24-26]。HA1第222位為D時，病毒主要識別人上呼吸道α-2,6-半乳糖唾液酸受體，HA1蛋白第222位一旦出現(xiàn)D222E、D222N或D222G突變，病毒就會更容易與下呼吸道α-2,3-半乳糖唾液酸受體結合，增加感染人下呼吸道的可能，從而使患者出現(xiàn)肺炎等嚴重的下呼吸道癥狀，此毒株A/Jilin-Chaoyang /SWL112/2019(H1)的HA1蛋白未出現(xiàn)D222E、D222N或D222G的突變，因此，引起患者的主要癥狀還是上呼吸道癥狀。

PB2和PB1基因分別位于流感病毒基因組第1個和第2個RNA節(jié)段上，編碼堿性聚合酶PB2和堿性聚合酶PB1，與酸性聚合酶 PA 共同組成RNA聚合酶復合物，參與流感病毒基因組的復制和轉錄[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，PB2蛋白出現(xiàn)E627K突變，會使甲型H1N1流感病毒的致病力增強[28]。而PB2蛋白出現(xiàn)D701N突變，可增強 PB2核定位能力，且S714R在D701N出現(xiàn)時也可顯著地提高病毒在宿主細胞的增殖能力，從而提高病毒的致病力。而PB1蛋白中如果出現(xiàn)G622D突變，會影響PB1蛋白與病毒RNA結合的能力，進而降低病毒的毒力。此外，NS基因位于病毒基因組第8個RNA節(jié)段上，主要編碼非結構蛋白，其中最重要的是NS1蛋白和NS2蛋白。NS1蛋白如果出現(xiàn)D92E突變，會使流感病毒對IFN等細胞因子的耐受性增強，從而影響流感病毒的致病力[29-30]。而NS2蛋白是一種核輸出蛋白，調節(jié)vRNP復合體從細胞核進入細胞質的過程[31]。有研究發(fā)現(xiàn)NS2的酶功能中心周圍被谷氨酸E環(huán)繞，如果E67S/E74S/E75S突變同時出現(xiàn)，會抑制流感病毒RNA聚合酶的活性，進而導致H1N1人流感病毒在小鼠體內的毒力減弱[32]。經(jīng)分析，此毒株A/Jilin-Chaoyang /SWL112/2019(H1)未出現(xiàn)上述重要位點突變。

甲型H1N1流感病毒的耐藥性也與病毒重要氨基酸位點的變異密切相關，分析與流感病毒耐藥相關氨基酸位點的變異情況對臨床治療具有十分重要的指導意義。目前,常用的抗流感病毒的藥物有：神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑類藥物，如奧司他韋；M2 蛋白抑制劑類藥物，如金剛烷胺；以及聚合酶抑制劑類藥物，如巴洛沙韋等，這幾類藥物針對流感病毒不同的蛋白，也具有不同的作用機制。神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物奧司他韋作用位點在NA蛋白，特別是NA蛋白H275Y的突變會引起奧司他韋的耐藥，已經(jīng)得到證實[33-34]。本次研究的A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)毒株，出現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶H275Y的突變，并伴有可能會改變H275Y突變株適應性的V241I，N369K同時突變[35]。除此之外，該毒株還出現(xiàn)N248D位點突變，可能會協(xié)同H275Y突變，改變與藥物作用的關鍵位點E277的結構，促進奧司他韋耐藥的發(fā)生[36]。而M2蛋白是烷胺類藥物的作用靶蛋白。M2蛋白跨膜區(qū)出現(xiàn)L26F、V27A、A30T/V、S31N、G34E中的1個或以上的突變，就會導致金剛烷胺類藥物耐藥株的出現(xiàn)。經(jīng)分析，此毒株M2跨膜區(qū)的第31位氨基酸為天冬酰胺(N)，提示其對金剛烷胺類藥物耐藥。聚合酶抑制劑類藥物巴洛沙韋作用位點在PA蛋白上，甲型H1N1流感病毒PA蛋白第38位出現(xiàn)I38T、I38M或I38F突變中的1個，都會使其對巴洛沙韋的敏感性降低[37-38]。此毒株PA蛋白未出現(xiàn)I38T、I38M或I38F突變，提示此毒株仍對聚合酶抑制劑類藥物巴洛沙韋敏感。

此外，系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)病毒株的HA和NA基因均與2018年美國康涅狄格州的病毒株A/Connecticut/41/2018親緣關系最近，而且出現(xiàn)在病毒株A/Connecticut/41/2018之后。進一步對A/Jilin- Chaoyang/SWL112/2019(H1)病毒株的HA和NA基因進行分析發(fā)現(xiàn)，A/Jilin-Chaoyang/SWL112/2019(H1)與A/Connecticut/41/2018的變異情況非常相似，不同之處是其HA基因在A/Connecticut/41/2018 的基礎上多了A48S 和F415L變異，而NA基因則多了Q78L和H275Y變異。

目前，新冠病毒疫情在全球范圍內肆虐，新冠病毒的持續(xù)變異使得其傳染性和致病性都發(fā)生了很大變化。在警惕新冠病毒變異株的同時，還應加強對流感病毒的抗原性、致病性、耐藥性等方面的監(jiān)測，防止由于流感病毒的變異和重組，引起新冠和流感“雙重大流行”。隨著流感病毒和新冠病毒的合并感染病例的出現(xiàn)，如何防止流感病毒和新冠病毒的合并感染，也將是我們今后需要研究的重要課題。