胎羊體外循環(huán)術(shù)后心臟和胎盤的代謝組學(xué)變化

吳文濤，滕 云，田 苗，黃冰鑫，李慧麗，譚劍鋒，李曉紅，周成斌

復(fù)雜先天性心臟病是我國新生兒和嬰幼兒死亡的主要原因之一。一些復(fù)雜先天性心臟病是由相對簡單的原發(fā)病變發(fā)展而來，若能在胎兒期進(jìn)行手術(shù)干預(yù)，則可阻止其向復(fù)雜畸形轉(zhuǎn)變，心臟也能在宮內(nèi)得到再次發(fā)育的機(jī)會。實(shí)施胎兒心臟手術(shù)需要安全可靠的體外循環(huán)（extracorporeal circulation，ECC）技術(shù)，既往動物研究也已證實(shí)胎兒ECC的可行性［1-3］。然而，胎兒ECC術(shù)后胎盤功能障礙［2］和心功能不全［3］仍是實(shí)驗(yàn)性胎兒心臟手術(shù)的致命缺陷。近年來，隨著組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，代謝組學(xué)已被用于研究ECC術(shù)后缺血再灌注損傷［4］、急性腎損傷［5］和腦缺血保護(hù)［6］。本研究構(gòu)建胎羊ECC模型，并對轉(zhuǎn)流后胎羊的心臟和胎盤組織進(jìn)行基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）的非靶代謝組學(xué)測序，目標(biāo)是闡明胎羊ECC后心臟和胎盤的代謝特征，并討論這些代謝改變是否與胎羊ECC術(shù)后器官功能不全有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物實(shí)驗(yàn)動物由山東鄆城縣大鵬農(nóng)牧科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動物倫理由廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：No.GDREC2019516A），動物實(shí)驗(yàn)過程遵守廣東省人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度。10只懷孕的小尾寒羊（孕90～120 d，總孕期148 d）隨機(jī)分為對照組（n=5）和轉(zhuǎn)流組（n=5）。轉(zhuǎn)流組開胸建立ECC，轉(zhuǎn)流1 h；對照組僅行胸骨切開，不進(jìn)行ECC，觀察1 h。

1.2 動物手術(shù)孕羊肌肉注射速眠新0.1 mg/kg行基礎(chǔ)麻醉，靜脈泵注丙泊酚4～6 mg/（kg·h）維持全身麻醉。然后進(jìn)行氣管插管和呼吸機(jī)輔助通氣，孕羊動脈氧飽和度維持100%，動脈二氧化碳分壓35 mmHg。監(jiān)測孕羊血壓和心率。

超聲探查胎羊數(shù)量及方位，中線剖腹手術(shù)暴露子宮。觸診判斷胎羊頭部和胸部相對位置，在胸骨附近切開孕羊子宮，暴露胎羊一側(cè)上肢，行腋動脈穿刺置管，監(jiān)測動脈血壓和心率。胎羊行正中胸骨切開術(shù)，打開心包暴露心臟。插管前靜脈注射肝素鈉3～5 mg（根據(jù)胎羊大小估計(jì)）。以7-0 Prolene（愛惜康）在主肺動脈縫制荷包，插入動脈插管（美敦力6 Fr動脈插管），右心耳以7-0 prolene線縫制帶心包扣的荷包，而后插入靜脈插管（美敦力12 Fr直頭引流管）。ECC采用離心泵（Revolution 5；索林）作為動力系統(tǒng)，人工膜肺（HIITE 800LT；米道斯）和胎盤共同作為氧合器，預(yù)充液由150 ml羊血、50 ml乳酸林格液和10 mg肝素組成。轉(zhuǎn)流過程中維持胎羊ECC流量在150 ml/（kg·min）以上，轉(zhuǎn)流時間為1 h。

1.3 超聲評估和血液檢測在轉(zhuǎn)流開始前（T0）、轉(zhuǎn)流30 min（T1）和轉(zhuǎn)流結(jié)束時（T2）對胎羊進(jìn)行超聲心動圖檢查。記錄超聲心動圖參數(shù)，包括左室（left ventricle，LV）-等容收縮時間（isovolemic contraction time，IVCT）、LV-等容舒張時間（isovolemic relaxation time，IVRT）、右室（right ventricle，RV）-IVCT、RV-IVRT、主動脈瓣內(nèi)徑（aortic valve diameter，AVD）、左室流出道（LV outflow tract，LVOT）-速度時間積分（velocity time integral，VTI）、肺動脈瓣內(nèi)徑（pulmonary valve diameter，PVD）、RVOT-VTI、臍動脈搏動指數(shù)（Umbilical artery pulsatility index，Ua-PI）、臍動脈阻力指數(shù)（Ua resistance index，Ua-RI）。采用公式［Tei指數(shù)=（IVCT-IVRT）/IVRT］計(jì)算左、右心室Tei指數(shù)。左室每搏輸出量（stroke volume-LV，SV-LV）由公式［SV-LV=LVOT-VTI×π×（AVD/2）2］得出，SV-RV由公式［SV-RV=RVOTVTI×π×（PVD/2）2］得出。

于T0、T1、T2采集靜脈血，進(jìn)行心肌酶檢測，包括肌紅蛋白（myoglobin，Myo）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CKMB）等；血?dú)夥治觯╬H、氧分壓、二氧化碳分壓、乳酸等。心肌酶檢測使用m16磁敏免疫分析儀（深圳理邦）進(jìn)行，血?dú)夥治鍪褂胕15血?dú)馍治鰞x（深圳理邦）進(jìn)行。

1.4 組織收集轉(zhuǎn)流結(jié)束后，對胎羊?qū)嵤┌矘匪?，迅速留取胎羊心臟和胎盤的組織標(biāo)本，液氮速凍后儲存在-80℃冰箱直至代謝物提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將母羊復(fù)蘇并送回農(nóng)場。

1.5 代謝物提取和UHPLC-MS/MS分析對凍存的組織樣本進(jìn)行代謝物提取和UHPLC-MS/MS分析，具體操作流程按文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行［7-8］。

1.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理與分析UHPLC-MS/MS生成的原始數(shù)據(jù)文件使用Compound Discoverer 3.1（CD3.1，賽默飛）進(jìn)行峰對齊、峰提取和代謝物定量。之后，將峰強(qiáng)度歸一化為總光譜強(qiáng)度，用歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分子式預(yù)測。然后用mzCloud（https://www.mzcloud.org/）、mzVault和MassList數(shù)據(jù)庫對峰進(jìn)行匹配，得到定性和相對定量結(jié)果。使用統(tǒng)計(jì)軟件R（R version R-3.4.3）、Python（Python 2.7.6 version）和CentOS（CentOS release 6.6）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布時，使用面積歸一化方法進(jìn)行正態(tài)轉(zhuǎn)換。使用京都基因與基因組百科全書（KEGG數(shù) 據(jù) 庫）（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、人類代謝（HMDB）數(shù)據(jù)庫（https://hmdb.ca/metabolite）和脂質(zhì)圖結(jié)構(gòu)（LMSD）數(shù)據(jù)庫（http://www.lipidmaps.org/）對鑒定到的代謝物進(jìn)行注釋。多元統(tǒng)計(jì)分析部分，使用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件metaX將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），進(jìn)而得每個代謝物的變量投影重要度（Variable importantce in projection，VIP）值。單變量分析部分，基于t檢驗(yàn)來計(jì)算各代謝物在兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P值），并計(jì)算代謝物在兩組間的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）值?；鹕綀D用R包ggplot2繪制。差異代謝物篩選的默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為VIP＞1，P值＜0.05且FC≥1.5或FC≤0.667。篩選完成后，采用MBRole 2.0（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole2/）［9］對鑒定到的差異代謝物進(jìn)行富集分析，以尋求顯著變化的代謝通路，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有分析均采用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，非正態(tài)資料用中位數(shù)和四分位數(shù)描述。組間比較采用重復(fù)測量方差分析，組內(nèi)不同時間點(diǎn)的比較采用配對t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)流組和對照組的胎羊體重?zé)o明顯差異［（2.10±0.59）kg vs.（1.49±0.86）kg，P=0.232］，胎齡無明顯差異［（97.00±9.75）d vs.（98.00±13.04）d，P=0.894］。與對照組相比，轉(zhuǎn)流組左右心室的Tei指數(shù)明顯增加（P＜0.05），并且轉(zhuǎn)流結(jié)束時Tei指數(shù)明顯高于轉(zhuǎn)流前（P＜0.05），提示胎羊心功能受損。轉(zhuǎn)流組SV-RV在轉(zhuǎn)流過程中逐漸下降，與對照組有顯著差異（P=0.004）。轉(zhuǎn)流組心率逐漸減慢，與對照組差別明顯（P=0.005），轉(zhuǎn)流30 min的心率明顯慢于轉(zhuǎn)流前（P=0.027）。轉(zhuǎn)流組在T1和T2的pH值明顯高于T0（P＜0.05），與對照組無明顯差異（表1）。對照組在T2的PCO2顯著高于T0（P=0.013），轉(zhuǎn)流組在T1和T2的PCO2顯著低于T0，兩組的PCO2變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0004）（表1）。轉(zhuǎn)流組乳酸值在轉(zhuǎn)流過程中明顯增加，與對照組比較有顯著差異（P=0.004）。轉(zhuǎn)流組的Ua-PI、Ua-RI和心肌酶無明顯改變，與對照組比較無明顯差異（表2）。

表1 胎羊血流動力學(xué)參數(shù)和轉(zhuǎn)流中的血?dú)庵底兓╪=5，±s）

表1 胎羊血流動力學(xué)參數(shù)和轉(zhuǎn)流中的血?dú)庵底兓╪=5，±s）

注：Ua-PI：臍動脈壓力指數(shù)；Ua-RI：臍動脈阻力指數(shù)；PO2：氧分壓；PCO2：二氧化碳分壓；Lac：乳酸；*P＜0.05與同組T0相比

對照組轉(zhuǎn)流組項(xiàng)目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2左室Tei指數(shù) 0.37±0.09 0.45±0.19 0.52±0.12 0.35±0.06 0.83±0.46 1.68±0.54* 0.049右室Tei指數(shù) 0.32±0.02 0.39±0.06 0.43±0.07 0.56±0.13 0.84±0.37 1.41±0.17* 0.003左室每搏量（ml/min） 2.49±0.65 2.38±0.40 2.44±0.38 2.68±0.57 1.91±0.79 1.34±0.72* 0.344右室每搏量（ml/min） 3.03±0.23 2.93±0.19 2.97±0.40 2.53±0.44 1.64±0.22 0.99±0.47 0.004 Ua-PI 1.35±0.46 1.32±0.38 1.36±0.43 1.07±0.39 1.23±0.22 1.25±0.31 0.598 Ua-RI 0.77±0.18 0.75±0.24 0.79±0.23 0.65±0.14 0.70±0.11 0.72±0.11 0.575心率（次/min） 148.67±15.28 133.67±14.84 134.67±10.02 138.50±21.33 88.00±11.17* 74.25±30.50 0.005 pH 7.24±0.06 7.32±0.10 7.27±0.09 7.20±0.06 7.34±0.07* 7.32±0.06* 0.796 PO2（mmHg） 23.00±3.61 25.33±1.15 20.33±1.15 20.00±2.55 24.60±8.44 32.60±16.16 0.576 PCO2（mmHg） 67.43±3.06 75.50±15.00 86.73±6.92* 75.38±12.95 36.60±10.74* 28.88±10.05* 0.0004 Lac（mmol/L） 1.98±0.61 1.56±0.80 1.89±0.59 2.19±0.76 6.53±1.72* 7.58±3.10* 0.004

表2 胎羊血液心肌酶的變化（n=5，±s）

表2 胎羊血液心肌酶的變化（n=5，±s）

注：Myo：肌紅蛋白；CKMB：肌酸激酶同工酶

對照組轉(zhuǎn)流組項(xiàng)目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2 Myo（μg/L） ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 -CKMB（μg/L） ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 -

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果

2.2.1 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性 為確保色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)過程中的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，在檢測目標(biāo)樣本的同時，隨機(jī)注入三個質(zhì)控（quality control，QC）樣本（QC樣本由目標(biāo)樣本混合而來）。QC樣本各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間基本相同，說明色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在整個實(shí)驗(yàn)過程中穩(wěn)定性良好。然后，利用峰面積計(jì)算三個QC樣本之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示（圖1），各QC樣本間相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明各QC樣本高度相關(guān)，代謝組結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)。

圖1 QC樣本間的Pearson相關(guān)系數(shù)

2.2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 多元統(tǒng)計(jì)分析采用PCA和PLS-DA。轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝譜基本分離，其95%置信區(qū)間僅部分重疊，提示ECC對胎羊的心臟代謝有顯著影響（圖2A）。轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝存在明顯重疊，提示ECC對胎盤代謝的影響較?。▓D2B）。此外，QC樣品集中在目標(biāo)樣品的中間區(qū)域，說明QC樣品具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，可以進(jìn)一步區(qū)分組間的代謝差異，但存在一定的過擬合風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)行排序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝譜在PLS-DA得分圖中明顯分離（圖3A），模型的評價(jià)參數(shù)R2Y和Q2Y均明顯大于0.5，提示模型有良好的穩(wěn)定性和較高的可預(yù)測性，轉(zhuǎn)流組和對照組的心臟代謝有明顯差異，在排序檢驗(yàn)圖中，R2＞0＞Q2，提示該模型未過擬合。轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝譜在PLS-DA得分圖中同樣明顯分離，但其評價(jià)參數(shù)Q2Y均明顯＜0.5，在正極性模式下Q2Y甚至＜0（圖3B），提示模型的可預(yù)測性和穩(wěn)定性較差，且存在一定的過擬合，轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝用PLS-DA也不能明顯區(qū)分，差異較小。

圖2 心臟和胎盤在兩種極性模式下的主成分分析圖

圖3 心臟和胎盤在兩種極性模式下的偏最小二乘法判別分析圖和排序驗(yàn)證圖

2.2.3 差異代謝物分析 結(jié)合單變量分析和多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，以VIP＞1，P＜0.05，且FC≥1.5或FC≤0.667作為閾值，進(jìn)行差異代謝物篩選。轉(zhuǎn)流組心臟相對于對照組，共鑒定出225種差異代謝物，其中負(fù)極性模式下123種（47種上調(diào)，76種下調(diào)），正極性模式下102種（47種上調(diào)，55種下調(diào)）。轉(zhuǎn)流組胎盤相對于對照組，共鑒定出122種差異代謝物，其中負(fù)極性模式下66種（14種上調(diào)，52種下調(diào)），正極性模式下56種（32種上調(diào)，2種下調(diào)）（圖4）。

圖4 心臟和胎盤在兩種極性模式下的火山圖

2.2.4 差異代謝通路分析 利用MBroles 2.0對差異代謝物進(jìn)行富集分析，顯示富集到的差異代謝通路有：糖代謝（三羧酸循環(huán)，磷酸戊糖途徑）、脂肪酸代謝（丁酸代謝、不飽和脂肪酸代謝）和氨基酸代謝（丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，組氨酸代謝，賴氨酸代謝）是ECC胎羊心臟的主要差異代謝途徑（圖5）。轉(zhuǎn)流組心臟組織中，神經(jīng)酸、二十二碳三烯酸、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等脂肪酸含量減少，?；鈮A增加，產(chǎn)物乙酰輔酶A增加，這表明脂肪酸利用明顯增加。生糖氨基酸（甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸等）的含量減少，糖代謝的能量底物（果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等）含量增加，三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物（琥珀酸、α-酮戊二酸、烏頭酸等）增加，表明能量代謝增加，糖異生增多。磷酸戊糖途徑中間產(chǎn)物（5-磷酸木酮糖、6-磷酸葡萄糖酸等）減少，合成代謝受阻。

轉(zhuǎn)流組胎盤的差異代謝通路主要包括不飽和脂肪酸代謝、花生四烯酸（arachidonate，ARA）代謝、谷胱甘肽代謝等（圖5B）。能量代謝方面，胎盤同樣表現(xiàn)為糖代謝底物（6-磷酸葡萄糖、1-磷酸葡萄糖）的增加以及多種生糖氨基酸和不飽和脂肪酸的減少，說明胎盤能量需求增加，募集的葡萄糖增多。ARA代謝和谷胱甘肽代謝則分別與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。

圖5 心臟和胎盤的通路富集氣泡圖

3 討 論

3.1 心功能和胎盤功能本研究選用孕90～120 d的羊構(gòu)建胎羊ECC模型，平均孕97.5 d，相當(dāng)于人孕25周，能夠較好地模擬人胎兒ECC手術(shù)的真實(shí)情況。既往動物研究表明，胎兒ECC可導(dǎo)致心功能不全［3］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)胎羊ECC導(dǎo)致左右心室的Tei指數(shù)明顯增加，SV和心率顯著下降。Tei指數(shù)是心室等容時間（包括IVCT和IVRT）與射血時間的比值，在胎兒心功能檢測方面不受心室?guī)缀涡螒B(tài)、心率和胎齡的影響，具有良好的可靠性和重復(fù)性［10］。心功能低下時Tei指數(shù)顯著增高。胎兒心肌收縮成分少，心肌舒張依賴細(xì)胞膜上的鈉鈣交換，因而胎兒心肌收縮和舒張功能比成熟心肌低下。胎兒心肌細(xì)胞處于最長肌節(jié)狀態(tài)，根據(jù)Frank-Starling定律，增加心臟容量，胎兒心臟每搏量的增加非常有限。因此，胎兒通過增加心率和雙心室做功來保持高循環(huán)動力狀態(tài)。在本研究中，轉(zhuǎn)流組胎羊的心率和SV均明顯下降，心輸出量顯著減少。Myo和CKMB是心肌損傷的標(biāo)志物之一，Myo通常在心肌損傷后1～4 h內(nèi)升高，在6～9 h達(dá)到峰值，CKMB在心肌損傷3～8 h開始升高，在12～24 h達(dá)到峰值。由于本研究觀察時間僅1 h，因此未觀察到Myo和CKMB的顯著變化。

胎盤功能障礙是胎兒ECC最常見的術(shù)后并發(fā)癥，具體表現(xiàn)為胎盤血管阻力升高、高碳酸血癥和不可逆酸中毒。在本研究中，Ua-PI和Ua-RI無明顯改變，并且PCO2逐漸降低，pH明顯改善。這可能是因?yàn)槿斯つし魏吞ケP共同作為氧合器，在轉(zhuǎn)流過程中提高了氣體交換能力，減輕了胎盤負(fù)荷。此外，胎羊ECC導(dǎo)致的胎盤功能惡化通常發(fā)生在術(shù)后數(shù)小時，本研究為獲取組織標(biāo)本，觀察時間較短，所以胎盤功能未見明顯惡化，但顯示血乳酸值在轉(zhuǎn)流過程中顯著增加，這表明胎兒的內(nèi)環(huán)境紊亂正在發(fā)生。

3.2 心臟代謝與心功能心臟是一種“雜食性”器官，具有很強(qiáng)的底物利用和環(huán)境適應(yīng)能力。在胎兒出生前，心臟以乳酸和葡萄糖作為主要的能量底物，在胎兒出生后，則迅速轉(zhuǎn)化為以脂肪酸代謝為主。這種代謝模式的轉(zhuǎn)變主要是由于出生前胎兒宮內(nèi)環(huán)境的相對缺氧和出生后新生兒能量需求的迅速增加［11］。在本研究觀察到轉(zhuǎn)流組胎羊的心臟發(fā)生了類似出生后的代謝模式轉(zhuǎn)換：多種脂肪酸含量減少，脂代謝明顯增加，三羧酸循環(huán)增強(qiáng)。這可能是因?yàn)镋CC作為一種應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)流組胎羊的能量需求增加，脂代謝激活。與糖酵解相比，脂代謝表現(xiàn)出更高的ATP產(chǎn)量，但生產(chǎn)1分子ATP所消耗的氧氣更多，這意味著轉(zhuǎn)流組胎羊心肌氧耗增加，負(fù)擔(dān)加重。此外，胎兒心肌細(xì)胞的線粒體處于未成熟狀態(tài)［11］，對氧化損傷的防御機(jī)制尚未完善，脂肪酸氧化增加會導(dǎo)致活性氧生成增多，線粒體損傷加重。因此，對于胎兒而言，這種能量代謝模式的轉(zhuǎn)變可能是胎羊ECC術(shù)后心功能不全的機(jī)制之一。

增加的脂代謝不僅會導(dǎo)致能量代謝紊亂，還會導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。變化的脂質(zhì)代謝物多為長鏈多不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA），包括：DHA、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等。Kajimoto等［12］用新生仔豬模型研究體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）對未成熟心臟代謝的影響，發(fā)現(xiàn)ECMO促進(jìn)未成熟心臟的長鏈脂肪酸氧化。在本研究中也觀察到胎羊ECC促進(jìn)LCPUFAs的氧化。多不飽和脂肪酸對于胎兒的生長發(fā)育是必不可少的。它們不僅是細(xì)胞膜的關(guān)鍵組成部分，還是一些代謝物的前體，對炎癥和神經(jīng)元生長有重要作用［13-14］。DHA和ARA缺乏會影響神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致胎兒和新生兒神經(jīng)元細(xì)胞的遷移延遲，增加神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險(xiǎn)［15］。EPA、DHA和ARA還可被代謝為類二十烷酸或類二十二烷酸（統(tǒng)稱為氧脂素），對維持自穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［16］。本研究中，胎羊ECC導(dǎo)致多不飽和脂肪酸的下降，不僅會降低胎羊維持氧化還原平衡和炎癥穩(wěn)態(tài)的能力，還有可能對胎羊的神經(jīng)發(fā)育造成不良影響。

氨基酸在胎兒體內(nèi)的主要功能是為生長發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)以及參與氧化反應(yīng)，當(dāng)營養(yǎng)缺乏和營養(yǎng)不良時，胎兒體內(nèi)的氨基酸代謝就會相應(yīng)增強(qiáng)。轉(zhuǎn)流組心臟存在氨基酸代謝的顯著改變，主要表現(xiàn)為生糖氨基酸的含量下降，包括天冬氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺等。轉(zhuǎn)流組胎羊能量需求明顯增加，并能較早利用氨基酸進(jìn)行糖異生，但這種消耗是以合成代謝下降為代價(jià)的，長時間應(yīng)激可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解增加和嚴(yán)重的負(fù)氮平衡，對胎羊的生長發(fā)育造成嚴(yán)重不良影響。

3.3 胎盤代謝與胎盤功能既往動物研究表明，胎兒ECC會導(dǎo)致胎盤功能障礙，可能的機(jī)制包括：炎性介質(zhì)沉積、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量下降、氧化應(yīng)激等［2-3，17］。本研究采用人工膜肺和胎盤共同作為氧合器，一定程度上減輕了胎盤負(fù)荷，并且停機(jī)后的觀察時間較短，因此未觀察到胎盤功能的明顯下降。同樣，在代謝層面，轉(zhuǎn)流組胎羊的代謝改變不明顯。雖然未能將轉(zhuǎn)流組和對照組的胎盤代謝完全區(qū)分，但轉(zhuǎn)流組胎盤的一些代謝變化可能預(yù)示了即將到來的胎盤損傷。

NO是以精氨酸為底物，以還原型輔酶Ⅱ作為電子供體，由一氧化氮合酶催化生成。精氨酸減少是胎盤功能不良的標(biāo)志［18］。轉(zhuǎn)流組胎盤的精氨酸（P=0.034）和同型精氨酸（P=0.033）明顯減少，NO合成的底物不足，這可能是轉(zhuǎn)流術(shù)后胎盤內(nèi)皮細(xì)胞NO合成障礙的新機(jī)制。與心臟相同，轉(zhuǎn)流組胎盤同樣存在脂肪酸氧化的增加，氧負(fù)擔(dān)加重。本研究采用人工膜肺和胎盤共同作為氧合器，在轉(zhuǎn)流期間對胎盤的氣體交換有一定輔助作用，但轉(zhuǎn)流結(jié)束后胎盤將面臨更重的氣體交換負(fù)擔(dān)，這可能是ECC術(shù)后胎盤功能惡化的原因之一。此外，脂肪酸氧化增加還會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷加重。作為主要的營養(yǎng)運(yùn)輸通道和調(diào)節(jié)器官，胎盤具有較強(qiáng)的對抗氧化應(yīng)激損傷的能力。棕櫚酸抗壞血酸酯、甜菜堿、還原性谷胱甘肽等具有抗氧化防御能力的代謝物在轉(zhuǎn)流組胎羊的胎盤中均明顯增加［19］，表明轉(zhuǎn)流組胎盤雖然面臨著氧化應(yīng)激損傷，但仍在代償范圍內(nèi)。隨著觀察時間的延長，這種氧化與抗氧化的平衡可能會被打破，嚴(yán)重的氧化應(yīng)激可能會進(jìn)一步損傷胎盤功能。

3.4 不足與展望本研究也存在一些不足。首先，本研究以胎羊?yàn)槟Ｐ吞接懱篍CC對器官組織代謝的影響，其結(jié)果不完全適用于人類胎兒。其次，本研究的動物數(shù)量較少，觀察時間較短，并且非靶向代謝組學(xué)只能進(jìn)行相對定量，結(jié)果可能存在一定誤差。應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長觀察時間，并采用靶向代謝組學(xué)對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。此外，每個器官內(nèi)部都有不同的細(xì)胞類型和功能區(qū)域。對于特定的代謝改變，器官可能具有區(qū)域特異性。在本研究中，只使用了器官樣本的一小部分，不能完全代表整個器官的代謝?？臻g代謝組學(xué)整合質(zhì)譜成像和代謝組學(xué)技術(shù)，對動/植物組織和細(xì)胞中內(nèi)/外源性代謝物的種類、含量和差異性空間分布進(jìn)行精準(zhǔn)測定［20］，其應(yīng)用將更有助于器官代謝的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究構(gòu)建了胎羊ECC模型1 h，研究顯示胎兒ECC影響心臟和胎盤組織代謝。轉(zhuǎn)流過程中心臟功能明顯下降，代謝改變主要變現(xiàn)為脂肪酸氧化和氨基酸分解增強(qiáng)；胎盤功能暫無明顯下降，代謝改變不顯著，但一些代謝物的變化提示胎盤功能在轉(zhuǎn)流結(jié)束后可能將逐漸惡化。本研究首次從代謝的角度對胎羊ECC術(shù)后心功能不全和胎盤功能障礙的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為胎兒ECC研究提供了新方向。