紅汁乳菇16個萜類合成酶基因的鑒定與表達1)

李云琴 王毅 原曉龍 楊文忠

(云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院)，昆明，650201)

食用菌是一類營養(yǎng)豐富、可供人們食用的大型真菌的總稱，菌根食用菌是外生菌根真菌中具有食用價值的大型真菌的統(tǒng)稱[1]。食用菌富含糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素，營養(yǎng)豐富、味道鮮美、質(zhì)地脆嫩，正在發(fā)展成為動物、植物性食物之外的第3類食物[2]，備受人們的青睞；除了良好的營養(yǎng)特性，真菌還具有多樣化的生理活性功能，其子實體，菌絲體和發(fā)酵液中均富含酚酸、萜類、多糖、維生素類、嘌呤類和有機酸等多種活性物質(zhì)[3]，能抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗炎等。真菌含有結(jié)構(gòu)類型豐富和生理活性多樣的次生代謝產(chǎn)物，為現(xiàn)代藥物獲取和保健食品、化妝品等的開發(fā)提供了重要的新資源[4-5]。

萜類化合物是天然產(chǎn)物中的最大家族，廣泛存在于真菌中[4]。目前報道的從真菌中分離得到的萜類化合物種類眾多，有單萜、倍半萜、二萜和三萜類化合物，萜類化合物以其豐富的生物活性，成為有機化學(xué)、藥物化學(xué)、生物學(xué)等多個學(xué)科和醫(yī)藥、香料、食品、農(nóng)業(yè)等多種產(chǎn)業(yè)極其重要的天然產(chǎn)物研究對象[4]。萜類化合物的通用結(jié)構(gòu)單元是C5前體異戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。DMAPP與1個或多個IPP連續(xù)縮合產(chǎn)生各種鏈長的線性二磷酸異戊烯化合物：香葉基二磷酸(C10，GPP)，法呢基焦磷酸(C15，F(xiàn)PP)，香葉基香葉基二磷酸(C20，GGPP)，這些前驅(qū)體由萜類合成酶(TPS)催化生成單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)，以及其他化合物[6]。因此，TPS被認為是萜類化合物生物合成的關(guān)鍵酶，由于其數(shù)量龐大，種類繁多，構(gòu)成了TPS基因家族，萜類合成酶種類和功能也決定了萜類化合物的多樣性，因而萜類合成酶成了萜類生物合成過程中研究最多和最深入的酶類[7]。

紅汁乳菇(Lactariushatsudake)為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)紅菇科(Russulaceae)乳菇屬(Lactarius)的菌根食用菌，在我國廣泛分布[8]。紅汁乳菇菌肉肥厚、味道鮮美、風(fēng)味獨特，富含氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等人體所需營養(yǎng)物質(zhì)，深受大眾喜愛[9]。不僅如此，紅汁乳菇還具有很好藥用功效，有研究表明其提取物對小白鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率分別達到100%和90%[10]；其乙醚和乙酸乙酯的提取物對大腸桿菌、沙門氏菌、啤酒酵母和枯草芽孢桿菌有抗菌作用[11]；多糖體對腫瘤有較高的抑制率[9]。另外，紅汁乳菇還可用于生產(chǎn)橡膠、營林[9]等，開發(fā)利用前景廣闊。但是目前為止，未見關(guān)于紅汁乳菇萜類活性成分及TPS基因的報道，本研究從紅汁乳菇基因組中分離出TPS基因，通過生物信息學(xué)及基因功能分析，以及在不同碳氮源培養(yǎng)基上的相對表達量的分析，基因簇分析等，為后續(xù)對紅汁乳菇中萜類活性物質(zhì)的研究和開發(fā)提供一些思路與參考，也為了產(chǎn)業(yè)化開發(fā)紅汁乳菇資源提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

從云南省宜良縣采集大小適中且完好的紅汁乳菇新鮮子實體帶回實驗室編號，并用75%酒精消毒，用食用菌組織分離法在無菌條件下切碎子實體后接種在MY(malt yeast extract,BD)斜面培養(yǎng)基上，避光28 ℃培養(yǎng)15 d，將菌落直徑為1 cm左右無污染的菌絲轉(zhuǎn)接到新的MY平板培養(yǎng)基上。經(jīng)過ITS鑒定為紅汁乳菇(Lactariushatsudake)，菌株號：YAF0304。

1.2 培養(yǎng)基

不同碳源培養(yǎng)基的配制，以3.0 g·L-1的酵母提取物和6.0 g·L-1的麥芽浸粉為基礎(chǔ)，分別添加10.0和2.0 g·L-12種質(zhì)量濃度的山梨醇、肌醇、甘露糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉；不同氮源培養(yǎng)基的配制，以6.0 g·L-1的葡萄糖和1.8 g·L-1的麥芽糖為基礎(chǔ)，分別添加6.0 g·L-1的馬鈴薯浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸粉和番茄浸粉；均在28 ℃條件下固體培養(yǎng)，檢測紅汁乳菇萜類合成酶基因的表達情況。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

將菌絲接種于上述培養(yǎng)基，28 ℃固體培養(yǎng)30 d后，菌絲體分裝為小份樣品(每份菌絲量50 mg)，在液氮中粉碎，參照康為世紀的RNA提取試劑盒提取總RNA，使用微量分光光度計Thermo NanoDrop 2000和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度以及完整性。參照北京全式金生物公司的試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4 紅汁乳菇全基因組中TPS基因的搜索與預(yù)測

我們以牛樟芝中的TPS為模板，采用本地BLAST在線軟件對紅汁乳菇的基因組進行比對分析，獲得候選基因序列后，并將候選基因序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫比對進行確定。

1.5 蛋白理化性質(zhì)分析

用ExPASy protparam tool、NetPhos 3.1 service、DictyOGlyc 1.1 service、signaIP-5.0、Euk-mPLoc 2.0 server、Prabi在線軟件(NPS@:SOPMA secondary structure prediction)分別分析蛋白理化性質(zhì)、氨基酸序列磷酸化修飾情況、O-糖基化修飾情況、蛋白的信號肽，蛋白亞細胞定位，蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.6 TPS蛋白序列多重比對、保守元件、進化樹構(gòu)建

將TPS蛋白序列導(dǎo)入到DNAMAN中，進行多重序列比對，利用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/tools/meme)對TPS蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測；將LhTPS蛋白序列進行BLAST比對，選擇同源性較高的蛋白，再根據(jù)參考文獻選擇一些有功能性的真菌TPS蛋白，將這些蛋白放在利MEGA 6.0進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.7 基因表達分析

使用DNAMAN在線程序primer設(shè)計紅汁乳菇TPS檢測引物，并由上海生工合成引物。以不同培養(yǎng)條件的紅汁乳菇cDNA作為模板，并以紅汁乳菇TPS檢測引物進行PCR擴增反應(yīng)，同時以內(nèi)參Tubulin引物作為對照。結(jié)束后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用Azure Biosystems成像系統(tǒng)軟件，將圖像信息轉(zhuǎn)化為基因表達量數(shù)據(jù)，以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用在線程序派森諾基因云(https://www.genescloud.cn/chart/)將相對表達量數(shù)據(jù)做成熱圖。

1.8 基因簇分析

使用在線程序antiSMASH(https://fungismash.secondarymetabolites.org)對16個紅汁乳菇TPS基因所在重疊群(contig)進行基因簇預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅汁乳菇中萜類合成酶蛋白的預(yù)測

利用本地BLAST對紅汁乳菇基因組數(shù)據(jù)進行分析比對，最終預(yù)測出16個LhTPS基因，分別命名為：LhTPS1、LhTPS2、LhTPS3、LhTPS4、LhTPS5、LhTPS6、LhTPS7、LhTPS8、LhTPS9、LhTPS10、LhTPS11、LhTPS12、LhTPS13、LhTPS14、LhTPS15、LhTPS16。

2.2 蛋白一級結(jié)構(gòu)分析

理化性質(zhì)預(yù)測分析(表1)結(jié)果表明除了紅汁乳菇LhTPS4的理論等點大于7外，其他15個蛋白的理論等電點均小于7，說明其蛋白質(zhì)分子中富含酸性氨基酸且酸性氨基酸數(shù)量多于堿性氨基酸；除LhTPS1、LhTPS2、LhTPS5、LhTPS9蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40外，其余11個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，說明紅汁乳菇LhTPS大多數(shù)為不穩(wěn)定蛋白。氨基酸親水性分析預(yù)測結(jié)果顯示，16個紅汁乳菇LhTPS的親水性平均系數(shù)(GRAVY)均為負值，表明均為親水性蛋白。磷酸與糖基化位點分析結(jié)果顯示LhTPS蛋白均具有酸磷酸化位點，然而16個蛋白的糖基化位點數(shù)均較少甚至沒有。

信號肽預(yù)測的結(jié)果顯示，所有蛋白序列均無N-端信號肽存在。蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，16個紅汁乳LhTPS中有10個LhTPS定位于細胞質(zhì)。

表1 紅汁乳菇TPS蛋白理化性質(zhì)分析

2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋、無規(guī)則卷曲、β折疊、延伸鏈等一系列多肽鏈本身的折疊盤繞方式。預(yù)測結(jié)果顯示(表1)，LhTPS二級結(jié)構(gòu)包含了α螺旋、無規(guī)則卷曲、β折疊、延伸鏈。除了LhTPS4以無規(guī)則卷曲占比最大外，其余15個蛋白均以α螺旋占比最大，β折疊、延伸鏈占比均較小。

2.4 蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域比對

利用MEME對紅汁乳菇16個LhTPS蛋白進行保守元件分析(圖1a)。motif2和motif4為紅汁乳菇LhTPS蛋白最顯著的保守結(jié)構(gòu)域：DXXD基序和NSE結(jié)構(gòu)域。LhTPS10蛋白只含有motif3；LhTPS13和LhTPS14包含3個motif，不包含motif4，僅具有萜烯合酶保守的DXXD基序；其余的蛋白均含有4個motif，均具有DXXD基序和NSE結(jié)構(gòu)域。DNAMAN比對分析(圖1b)也發(fā)現(xiàn)，LhTPS10、LhTPS13、LhTPS14僅具有萜烯合酶的DXXD保守結(jié)構(gòu)域，其余的蛋白均具有DXXD和NSE保守結(jié)構(gòu)域。因此可以把16個萜類合成酶分成兩類，LhTPS10、LhTPS13、LhTPS14為一類，其余13個蛋白分為一類。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析

通過文獻收集和BLAST在線軟件同源比對，獲得了一些植物及真菌的萜類合成酶基因的蛋白序列，在MEGA6.0軟件上與16個紅汁乳菇LhTPS蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示，16個LhTPS可分為4個大分支，其中LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16、LhTPS7為第Ⅰ分支；LhTPS4、LhTPS2、LhTPS12、LhTPS3、LhTPS5、LhTPS15為第Ⅱ分支；LhTPS14、LhTPS10、LhTPS13為第Ⅲ分支；LhTPS1和LhTPS9為第Ⅳ分支。按已有文獻分析，第Ⅰ、Ⅱ分支為倍半萜合成酶，第Ⅲ分支為倍半萜及二萜合成酶，第Ⅳ分支為倍半萜和三萜合成酶。第Ⅰ分支中LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16與發(fā)光類臍菇(OmphalotusoleariusMUStwsD_GLEAN_10000831，Δ-6 protoilludene)[12]和高盧蜜環(huán)菌(ArmillariagallicaP0DL13.1，Δ-6 protoilludene)[13]的倍半萜合酶聚在一起，由此推測LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16主要生成Δ-6 protoilludene的相似物或者衍生物；LhTPS7與發(fā)光類臍菇(OmphalotusoleariusMUStwsD_GLEAN_10000810/MUStwsD_GLEAN_10000811，γ-cadinene)[12]聚在一起，由此推測LhTPS7主要生成γ-cadinene的相似物或者衍生物。第Ⅱ分支中的LhTPS4、LhTPS2、LhTPS12、LhTPS3、LhTPS5、LhTPS15與虎乳靈芝(LignosusrhinocerusKX281944/ASK39768，δ-cadinol)[14]、發(fā)光類臍菇(OmphalotusoleariusMUStwsD_GLEAN_10001317，α-muurolene)[12]、牛樟芝(AntrodiacinnamomeaEIW57365，1-epi-cubenol)[15]的倍半萜合成酶聚在一起，由此初步推測第Ⅱ分支的紅汁乳菇LhTPS主要生成δ-cadinol、α-muurolene、1-epi-cubenol的相似物或者衍生物。LhTPS14、LhTPS10、LhTPS13聚為第Ⅲ分支，與保守基序分析結(jié)果一樣。LhTPS14與巨冷杉(AbiesgrandisAAC05728，γ-Humulene synthase)[16]聚在一起，初步推測LhTPS14為二萜合成酶γ-Humulene synthase；LhTPS10與毛韌革菌(StereumhirsutumXP_007299839，δ-cadinene)[17]倍半萜合成酶聚在一起，且可信度較高，由此推測LhTPS10為倍半萜合成酶，且主要生成δ-cadinene的類似物或者衍生物；LhTPS13與牛樟芝(AntrodiacinnamomeaEIW53985，nerolidol)[15]的倍半萜合成酶聚集在一起。第Ⅳ分支的可信度偏低，LhTPS1與灰蓋鬼傘(CoprinuscinereusXP_001836556，germacrene A)[18]的倍半萜合成酶聚在一起，LhTPS9與香菇(LentinulaedodesGAW09328)的三萜鯊烯合酶squalene synthase聚為一起。

圖1 LhTPS蛋白基序分析和保守結(jié)構(gòu)域多重序列比對

圖2 紅汁乳菇LhTPS蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 不同培養(yǎng)條件下紅汁乳菇LhTPS表達驗證及分析

紅汁乳菇16個LhTPS基因中，有些基因較小，因此沒有做不同碳氮源情況的表達分析，僅對10個基因(LhTPS2、LhTPS3、LhTPS4、LhTPS5、LhTPS6、LhTPS7、LhTPS8、LhTPS12、LhTPS15、LhTPS16)進行分析，并制作成表達熱圖(圖3)，其結(jié)果顯示10個LhTPS基因在不同碳氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下均有表達，總體情況來看，紅汁乳菇10個LhTPS基因分別依次在2.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基、10.0 g·L-1肌醇培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、牛肉浸粉培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、胰蛋白胨培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、10.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體中表達量最高；不同氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達情況整體上要優(yōu)于不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達情況。在不同碳源及不同質(zhì)量濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，紅汁乳菇10個LhTPS基因分別在2.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1肌醇、10.0 g·L-1山梨醇、2.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1肌醇、10.0 g·L-1麥芽糖、10.0 g·L-1山梨醇、2.0 g·L-1甘露醇、10.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基上表達量最高；因此，在不同碳源及質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，以10.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基為最優(yōu)，然后依次是10.0 g·L-1肌醇培養(yǎng)基，2.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基。在不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，紅汁乳菇10個LhTPS基因分別在番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨、番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉培養(yǎng)基中表達量最高；因此，在不同氮源培養(yǎng)基中以番茄培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基。

mal-1為2.0 g·L-1麥芽糖；mal-2為10.0 g·L-1麥芽糖；man-1為2.0 g·L-1甘露醇；man-2為10.0 g·L-1甘露醇；fru-1為2.0 g·L-1果糖；fru-2為10.0 g·L-1果糖；suc-1為2.0 g·L-1蔗糖；suc-2為10.0 g·L-1蔗糖；sor-1為2.0 g·L-1山梨醇；sor-2為10.0 g·L-1山梨醇；glu-1為2.0 g·L-1葡萄糖；glu-2為10.0 g·L-1葡萄糖；ino-1為2.0 g·L-1肌醇；ino-2為10.0 g·L-1肌醇；sta-1為2.0 g·L-1可溶性淀粉；sta-2為10.0 g·L-1可溶性淀粉；S為大豆蛋白胨；P為馬鈴薯浸粉；B為牛肉浸粉；T1為胰蛋白胨；T為番茄浸粉。

2.7 基因簇預(yù)測分析

對16個紅汁乳菇LhTPS蛋白編碼基因所在重疊群進行基因簇分析后發(fā)現(xiàn)，LhTPS2、LhTPS3、LhTPS6、LhTPS8、LhTPS9、LhTPS10、LhTPS15編碼基因所在重疊群有基因簇的存在。其中，LhTPS9、LhTPS15的編碼基因所在重疊群有細胞色素P450氧化還原酶基因存在，可能為TPS與P450組成的基因簇(圖4)。

圖4 5個紅汁乳菇TPS基因簇預(yù)測

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)代藥學(xué)對于新化合物的需求不斷增加，而微生物資源的開發(fā)與利用為藥物研發(fā)帶來了新的機遇，從微生物次級代謝產(chǎn)物中獲得天然產(chǎn)物是新的前體化合物的重要來源[19]。研究發(fā)現(xiàn)具有新的結(jié)構(gòu)與活性的次生代謝產(chǎn)物超過50%來源于真菌[20]，因此深度挖掘真菌中天然活性化合物對藥物研發(fā)具有重要的意義。

紅汁乳菇不僅是人們最喜歡的野生食用菌之一，它還具有多種活性成分，開發(fā)利用前景廣闊，但是目前，對紅汁乳菇TPS基因的分析研究尚未見報道。本研究從紅汁乳菇全基因組中分離獲得16個萜類合成酶基因，基序分析將16個LhTPS分成兩類，僅有DXXD基序的分為一類，有DXXD基序和NSE結(jié)構(gòu)域歸為另一類；系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將16個LhTPS分為4個大分支，僅有DXXD基序的聚集為一個分支。推測第Ⅰ、Ⅱ分支為倍半萜合成酶，第Ⅲ分支為倍半萜及二萜合成酶，第Ⅳ分支為倍半萜和三萜合成酶。其中第Ⅰ分支中的LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16主要生成Δ-6 protoilludene的相似物或者衍生物，LhTPS7主要生成γ-cadinene的相似物或者衍生物；第Ⅲ分支中的LhTPS10為倍半萜合成酶，且主要生成δ-cadinene的類似物或者衍生物。

真菌基因組蘊含著大量次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇[20-21]，大部分基因簇在常規(guī)的培養(yǎng)條件下是“沉默”的，在實驗室培養(yǎng)條件下，只有10%～20%次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇能從其發(fā)酵粗提物中檢測到相應(yīng)的產(chǎn)物[22]，說明還有大量結(jié)構(gòu)新穎的潛在活性化合物未從“沉默”基因簇中鑒定出來[22]。因此，挖掘真菌的潛在新化合物正成為國內(nèi)外研究的熱點。研究者使用Helge等提出的單菌多產(chǎn)物(One Strain-Many Compounds,OSMAC)策略[23]，從真菌中分離鑒定了一系列結(jié)構(gòu)新穎、具有多種活性的化合物，通過培養(yǎng)基篩選，從毛韌革菌(Stereumhirsutum)發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了4個倍半萜，還有氨基酸雜合的季銨鹽Stereumamides A-D，具有一定的抗菌活性[24]；通過改變培養(yǎng)水，使用自來水和蒸餾水培養(yǎng)植物伴生真菌Paraphaeosphaeriaquadriseptata，主代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化，得到的其中2個化合物對腫瘤細胞株NCI-H460，MCF-7和SF-268有較為顯著的細胞毒活性[25]；通過海洋真菌Libertellasp．與細菌α-proteobacterium聯(lián)合培養(yǎng)，得到了分別培養(yǎng)所沒有得到的化合物對人結(jié)腸癌HCT-116具有較強的細胞毒活性[26]。本研究通過僅改變碳源添加物及質(zhì)量濃度和氮源添加物來探究不同培養(yǎng)基對紅汁乳菇萜類合成酶基因表達的影響。結(jié)果顯示在加有不同氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達情況整體上要優(yōu)于不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達情況，且以10.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1肌醇為碳源的培養(yǎng)基和番茄浸粉為氮源的培養(yǎng)基上表達量相對較高，與原曉龍等[27]研究紅汁乳菇Lhpks1基因表達情況一致。對紅汁乳菇LhTPS基因簇分析發(fā)現(xiàn)LhTPS2、LhTPS3、LhTPS6、LhTPS8、LhTPS9、LhTPS10、LhTPS15編碼基因所在重疊群有基因簇的存在，但僅LhTPS6、LhTPS8、LhTPS10初步推斷出其功能，后續(xù)研究可以在對推測出的功能基因和基因簇進行進一步驗證分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)OSMAC策略以及一些激活沉默基因和基因簇的方法如強啟動子替換[28]、基因的過表達、異源表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、重構(gòu)生物合成基因簇[24-25]等等來刺激不同的基因或基因簇，以得到目標化合物或獲取一些新的活性物質(zhì)，以此挖掘紅汁乳菇中可能蘊藏的潛在化合物。

真菌次生代謝產(chǎn)物合成途徑中往往包括多樣化的氧化過程，細胞色素P450能夠催化不同類型的氧化反應(yīng)而參與到真菌次生代謝產(chǎn)物的合成途徑中[29]，參與次生代謝產(chǎn)物合成途徑的細胞色素P450往往會出現(xiàn)在次生代謝產(chǎn)物合成酶基因簇區(qū)域[30]。基因簇分析發(fā)現(xiàn)LhTPS9、LhTPS15的編碼基因所在重疊群有細胞色素P450氧化還原酶基因存在。下一步研究可開展對于紅汁乳菇中與活性天然產(chǎn)物相關(guān)的細胞色素P450的氧化途徑、結(jié)構(gòu)與功能的進一步揭示與闡明。

本研究為紅汁乳菇潛在次生代謝產(chǎn)物合成基因的挖掘和深度研究紅汁乳菇中天然活性化合物奠定基礎(chǔ)。