復(fù)合綠茶對高脂血癥小鼠有機(jī)酸代謝的影響

梅鑫，宋玉顏，田維素，2，郭菥鎣，2，木仁，楊再波，周才碧*

（1.黔南民族師范學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福建 福州 350000；3.黔南民族師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 都勻 558000）

隨著人們生活水平的提高，不良的生活方式和不均衡的膳食結(jié)構(gòu)導(dǎo)致高脂血癥并引發(fā)脂肪肝、糖尿病、冠心病等多種疾病[1]。高脂血癥是指由于飲食習(xí)慣、生活環(huán)境以及個(gè)人身體素質(zhì)等因素導(dǎo)致血漿中低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglycerides，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）發(fā)生異常的一種全身脂代謝紊亂疾病[2-3]。目前，研究者已針對高脂血癥研發(fā)出多種治療方法和化學(xué)合成藥物，他汀類藥物作為臨床調(diào)脂藥的首選，長期使用存在誘發(fā)肝腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)，其作用機(jī)制可能與其改變體內(nèi)膽汁酸代謝而引起膽汁酸淤積有關(guān)[4]。

茶具有減肥、消炎、殺菌、抗癌等作用[5]。相關(guān)研究表明茶葉可通過改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來調(diào)節(jié)編碼肝臟中糖生成酶及蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化酶的基因，抑制大鼠肝癌H4IIE細(xì)胞降低肝損傷的嚴(yán)重程度[6-10]。攝入速溶普洱紅茶能夠有效降低小鼠血脂中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性[11]。連翹葉茶可提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，減少小鼠肝臟中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，增強(qiáng)抗氧化能力，減少自由基的產(chǎn)生，緩解細(xì)胞因子導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷進(jìn)而對肝臟起到保護(hù)作用[12]?？喽〔枳鳛橐环N藥用植物，其降糖、降脂活性成分已被用于藥理研究。研究表明，苦丁茶可調(diào)節(jié)小鼠因攝入高脂飼料而導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂，其機(jī)理可能與苦丁茶中的某些有效成分能促進(jìn)肝臟中羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxymethylglutaryl coenzyme A，HMGCoA）還原酶基因表達(dá)有關(guān)，從而抑制脂肪酸合成酶活性，誘導(dǎo)肝臟中TC的合成與攝取，增加膽汁酸的排泄[11-13]。復(fù)合茶可以降低因高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟和代謝紊亂，減少肝臟脂肪變性，具有抗糖尿病、抗炎和抗氧化作用，防止肝臟脂肪堆積[14]。因此茶作為一種天然、安全的植物資源，深入開發(fā)其降脂活性成分具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。

代謝組學(xué)是對相關(guān)代謝物質(zhì)代謝產(chǎn)物分析的一門技術(shù)，主要觀察生物體因遺傳修飾和生理或病理刺激而引起的差異代謝物的變化過程[15]。代謝組學(xué)是一種整體生物體系分析手段，可通過代謝圖譜直接判別機(jī)體生理與生化狀態(tài)，是對基因組學(xué)和其他組學(xué)的重要補(bǔ)充，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、食品營養(yǎng)科學(xué)等領(lǐng)域[16-17]。本文利用代謝組學(xué)技術(shù)，研究復(fù)合茶對高脂血癥小鼠肝臟代謝的影響，旨在探索復(fù)合茶的降脂機(jī)理，為該復(fù)合茶的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

都勻古樹綠茶：貴州碧豎科技服務(wù)有限公司；都勻原樹甜茶、都勻闊葉苦丁、荷葉、野薄荷、金銀花：市售。本實(shí)驗(yàn)采用都勻古樹綠茶、都勻原樹甜茶、都勻闊葉苦丁、荷葉、野薄荷、金銀花拼配而成的復(fù)合茶。

甲醇、乙醇、乙腈（均為色譜純）：美國Thermo Fisher Scientific公司。

實(shí)驗(yàn)動物：SPF 級雄性 KM 小鼠，體重（30±2）g，約5周齡（許可證號：430726210100155263），上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CTO-20AC柱溫箱、IT-TOF質(zhì)譜儀、CBM-20A系統(tǒng)控制器、DGU-20A5R在線脫氣機(jī)、SIL-30AC自動進(jìn)樣器、LC-30AD液相輸液泵：日本島津公司；GenPure UV-TOC/UF xCAD超純水器、Forma700超低溫冰箱：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 茶樣制備

取適量復(fù)合茶樣品將其粉碎，按1∶10（g/mL）的茶水比于100℃沸水中浸提30 min，真空抽濾后茶渣按同樣的方法再浸提一次，合并兩次提取液。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適當(dāng)濃度，于-80℃預(yù)冷12 h后真空干燥30 h，收集干粉，貯存于超低溫冰箱中。

1.4 動物實(shí)驗(yàn)

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d的健康雄性KM小鼠，隨機(jī)分成為高脂模型組（NK）、復(fù)合茶低濃度組（DL）、復(fù)合茶高濃度組（DH）3組，每組10只。3組小鼠均飼喂高脂飼料，NK組灌胃飲用水，復(fù)合茶高（840 mg/kg）、低劑量組（210 mg/kg）灌胃不同濃度的復(fù)合茶湯。小鼠飼養(yǎng)在溫度為20℃～26℃、相對濕度50%～60%的老鼠房內(nèi)；小鼠灌胃體積為0.1 mL/10 g，每周根據(jù)其稱重體積調(diào)整灌胃量，隔天更換一次墊料，每周更換飲用水。

1.5 樣品制備

實(shí)驗(yàn)周期1個(gè)月，結(jié)束后取小鼠肝組織，用預(yù)冷的生理鹽水將血液漂洗干凈。準(zhǔn)確稱取50 mg小鼠肝組織，加入1 000 μL預(yù)冷提取劑（70%的甲醇水溶液，含1 μg/mL的2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)），進(jìn)行渦旋勻漿1 min，冷凍靜置 15min；離心 10min（4℃、12000r/min），取上清液于進(jìn)樣瓶，待檢測。

1.6 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCHSS T3C18（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A相為超純水（0.04%乙酸），B相為乙腈（0.04%乙酸）；洗脫梯度：0 min水/乙腈（95∶5體積比），11.0 min為5∶95體積比，12.0 min為5∶95體積比，12.1 min為 95∶5體積比，14.0 min為95∶5體積比；流速0.4mL/min，柱溫40℃；進(jìn)樣量2μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray Ionization，ESI）溫度 500℃，質(zhì)譜電壓+5500V（正），-4500V（負(fù)），離子源氣體I55，氣體II（GS II）60 psi（1 psi=6.895 kPa）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Analyst1.6.3軟件及三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)及進(jìn)行定量分析，對所有代謝物進(jìn)行峰提取和峰校正。所有數(shù)據(jù)集經(jīng)過處理后用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型進(jìn)行分析，以預(yù)測參數(shù)R2X、R2Y和Q2的值來評價(jià)模型的有效性，它們的大小直接反映了模型的可靠程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

將3組樣品混合制備成質(zhì)控樣本（quality control sample，QC），分析樣本在同樣處理方法下的重復(fù)性。利用軟件Analyst 1.6.3進(jìn)行峰的積分和校準(zhǔn)模式得到圖1。

圖1 混樣質(zhì)控QC樣本的總離子流圖及MRM代謝物檢測多峰圖Fig.1 Total ion flow pattern and MRM metabolite detection of QC samples with mixed quality control

2.2 代謝物的定性和定量分析

經(jīng)過代謝物的定性和定量分析，共檢測到121個(gè)有機(jī)酸及其衍生物，包括尿囊素、（S）-2-羥基丁酸、2-氨基乙烷磺酸/?；撬?、3-羥基丙酸、DL-甘油醛-3-磷酸、二羥丙酮磷酸、阿斯巴甜、咖啡酸、肉桂酸、L-乳酸、扁桃酸、D-羥基丙酸、尿刊酸、糠醛等物質(zhì)。

2.3 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）二維得分圖和三維圖見圖2。

由圖2可知，主成分分析的質(zhì)量控制和處理表明，每組茶樣處理內(nèi)樣品間的差異都很小，樣品具有相似的代謝特性，測試結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)。此外，茶樣處理之間的分離趨勢很明顯，表明處理組之間存在明顯的代謝差異；3組處理的代謝在第一組分（PC1）中能夠分離，表明茶樣處理對高脂小鼠的有機(jī)酸代謝的影響明顯。

圖2 主成分分析（PCA）二維得分圖和三維圖Fig.2 Principal component analysis（PCA）two dimensional score map and three dimensional graph

對于DH、DL組的樣本不能完全聚在一起形成獨(dú)立的區(qū)域，但與NK組相比部分分離，表明模型組與低濃度茶樣處理組、高濃度茶樣處理組小鼠在代謝上具有一定的差別。DL、DH組分離趨勢不顯著，表明茶樣處理組之間的代謝成分相似。

2.4 正交偏最小二乘判別分析

通過正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）將X矩陣信息分解為Y相關(guān)和不相關(guān)[18]，為了篩選差異變量，消除不相關(guān)的差異。PLS-DA可最大程度地區(qū)分組間差異，更有助于發(fā)現(xiàn)差異代謝物。OPLS-DA模型的評分、驗(yàn)證圖、S-plot見圖3。

圖3 OPLS-DA模型的評分、驗(yàn)證圖、S-plotFig.3 Scoring，validation and S-plot of OPLS-DA model

由圖3可知，R2Y和Q2分?jǐn)?shù)均大于0.99，表明茶樣處理導(dǎo)致高脂小鼠的有機(jī)酸代謝差異。通過200次隨機(jī)排列組合驗(yàn)證試驗(yàn)證明了OPLS-DA模型的可靠性，水平線對應(yīng)于原始模型的R2和Q2；而紅色和藍(lán)色點(diǎn)分別代表替換后的R2’和Q2’，驗(yàn)證結(jié)果表明該模型是有意義的，且可以在隨后的分析中根據(jù)特征變異投影重要性（variable importance in projection，VIP）值分析來篩選差異代謝物。

與模型組相比，低濃度茶樣處理組咖啡酸、磷酸二羥丙酮、乙酰水楊酸差異明顯，高濃度茶樣處理組咖啡酸、?；撬?、肉桂酸差異明顯。表明經(jīng)不同濃度復(fù)合茶處理后有機(jī)酸代謝物質(zhì)變化明顯。

2.5 層次聚類分析與火山圖

差異代謝物的火山圖、VIP值圖、相關(guān)性熱圖、韋恩圖、條形值圖見圖4。

圖4 差異代謝物的火山圖、VIP值圖、相關(guān)性熱圖、韋恩圖、條形值圖Fig.4 Volcano map，VIP value map，correlation heat map，Wayne map and bar value map of different metabolites

層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）可以評估茶樣處理導(dǎo)致高脂小鼠有機(jī)酸代謝物積累的特征差異，包括處理內(nèi)的同質(zhì)性和處理間的變異性。由圖4可知，隨著復(fù)合茶濃度的增加，代謝物的表達(dá)差異也增大。由差異代謝物火山圖可知，大多數(shù)代謝物的表達(dá)沒有太大差異，上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物個(gè)數(shù)相近；NK比DL組中發(fā)現(xiàn)差異代謝物上調(diào)3個(gè)、下調(diào)6個(gè)，NK比DH組中發(fā)現(xiàn)差異代謝物下調(diào)13個(gè)，DL比DH組中發(fā)現(xiàn)差異代謝物上調(diào)1個(gè)、下調(diào)10個(gè)。

2.6 差異代謝物的統(tǒng)計(jì)分析

差異顯著的代謝物見表1。

表1 差異顯著的代謝物Table 1 The metabolites with significant difference

由表1可知，檢測到有機(jī)酸及其衍生物121個(gè)。與高脂模型組相比，高濃度茶樣處理組中（S）-2-羥基丁酸、2-羥基-4-甲基戊酸、D-羥基丙酸、DL-甘油醛-3-磷酸、磷酸二羥丙酮等13個(gè)代謝物顯著下調(diào)；低濃度茶樣組中（S）-2-羥基丁酸、DL-甘油醛-3-磷酸、磷酸二羥丙酮、糠醛、咖啡酸、尿刊酸6個(gè)代謝物顯著下調(diào)，羥基異己酸乙酯、咖啡酸、N-油酰甘氨酸3個(gè)代謝物上調(diào)。

與低濃度茶樣組相比，高濃度茶樣組中2-羥基-4-甲基戊酸、磷酸二羥丙酮、DL-甘油醛-3-磷酸、5-羥基己酸等10個(gè)代謝物下調(diào)，咖啡酸1個(gè)代謝物上調(diào)。與高脂模型組相比，不同濃度茶樣處理之間發(fā)現(xiàn)（S）-2-羥基丁酸、糠醛、DL-甘油醛-3-磷酸、磷酸二羥丙酮這兩個(gè)有機(jī)酸及其衍生物均為下調(diào)。

2.7 差異代謝物的功能注釋與富集分析

差異代謝物的功能注釋與富集分析見圖5～圖7。

圖5 差異代謝物的功能注釋和富集分析Fig.5 Functional annotation and enrichment analysis of different metabolites

圖6 茶樣處理高脂小鼠肝臟有機(jī)酸代謝反應(yīng)Fig.6 Metabolic reaction of organic acids in liver of high fat mice treated with tea

圖7 茶樣處理高脂小鼠肝臟中某些重要物質(zhì)的代謝途徑示意圖Fig.7 Metabolic pathway of some important substances in the liver of high fat mice treated with tea sample

根據(jù)通路歸屬分析定位差異代謝物對應(yīng)的代謝途徑，其在生物體內(nèi)相互作用，形成不同的通路，尋找到組間有差異的代謝途徑。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行注釋，并展示差異代謝物主要參與次生代謝物的代謝途徑和生物合成[19]。如磷酸二羥丙酮、D-羥基丙酸、L-乳酸、糠醛、咖啡酸、尿刊酸等物質(zhì)。這些代謝物含量的變化與新陳代謝、磷酸肌醇代謝、糖酵解/糖質(zhì)新生、丙酮酸代謝、糠醛降解、胰高糖素信號通路、果糖和甘露糖代謝有關(guān)，說明其可能參與肝細(xì)胞糖原的分解，從而在維持體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的重要代謝過程中發(fā)揮重要作用。

差異代謝物KEGG通路圖見圖8。

圖8 差異代謝物KEGG通路圖Fig.8 KEGG pathway of different metabolites

3 討論

苦丁茶中富含二咖啡酰基奎寧酸異構(gòu)體和三萜皂苷等有機(jī)酸及其衍生物，具有降血脂、抗氧化、殺菌減脂作用，因此可以用作降脂[13]。金銀花是一種常見的中藥材，經(jīng)過現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)金銀花具有抗菌、抗氧化，護(hù)肝等功效[20]。金銀花中主要有效成分為綠原酸類化合物，其他有機(jī)酸還包括咖啡酸及棕櫚酸[21]。在本研究中，與模型對照組相比，低濃度茶樣處理導(dǎo)致咖啡酸等有機(jī)酸的下降。綠原酸屬于縮酚酸，由咖啡酸與奎尼酸生成，具有緩解血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、ALT、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）和總膽汁酸（total bile acid，TBA）升高，調(diào)控肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的表達(dá)，降低膽汁酸對肝細(xì)胞的毒性等功能，從而起到肝保護(hù)作用[22]。在本研究中，與低濃度茶樣處理組相比，高濃度導(dǎo)致咖啡酸含量的上升。理論上這一通路的表達(dá)原本會造成咖啡酸的降低，但高濃度處理結(jié)果上升，具體分析還有待進(jìn)一步研究。

與模型對照組相比，低濃度茶樣處理后檢測到尿刊酸下調(diào)，而高濃度茶樣處理組并未檢測到。已經(jīng)證明，尿刊酸是L-組氨酸分解代謝的中間體，與組氨酸代謝有關(guān)，在茶樣處理后的該物質(zhì)的變化具有一定作用。組氨酸磷酸酶具有去磷酸化作用，其失調(diào)可導(dǎo)致心情郁悶、抑郁癥等。在大多數(shù)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中組氨酸磷酸酶起著至關(guān)重要的作用，可作為一種生物標(biāo)記物，為疾病的診斷與治療提供新的思路與治療靶點(diǎn)[23]。

磷酸二羥丙酮是聯(lián)絡(luò)甘油和葡萄糖的化學(xué)物質(zhì)，主要參與糖酵解、甘油異生、丙酸鹽代謝以及果糖和甘露糖代謝等新陳代謝過程。在本研究中，與模型對照組相比，茶樣處理組間導(dǎo)致磷酸二羥丙酮下調(diào)，以及與低濃度茶樣處理組相比，高濃度茶樣處理中磷酸二羥丙酮下調(diào)。這可能意味著隨著茶樣濃度增加，糖酵解、甘油異生、丙酸鹽代謝以及果糖和甘露糖代謝等新陳代謝作用增加，從而導(dǎo)致小鼠血脂降低，改善血脂紊亂。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測平臺的廣泛靶向代謝組技術(shù)來分析不同茶樣濃度處理的小鼠肝臟代謝差異，篩選出與高脂血癥有關(guān)的有機(jī)酸及其衍生物共有121種，初步揭示了喂食都勻復(fù)合茶能緩解高脂血癥小鼠血脂紊亂的作用機(jī)制，為了解茶葉的功能和降脂功效提供了重要的理論基礎(chǔ)。