海紅米米糠對慢性應激誘導小鼠抑郁樣行為和異常腸道微生物及神經(jīng)遞質(zhì)的改善作用

李曉紅， Rabia Parveen， 楊志友， 張永平，周鴻凱， 劉文超， 蘇偉明， 宋 采

(廣東海洋大學食品科技學院1，湛江 524088)(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室2，湛江 524088)(廣東海洋大學濱海農(nóng)業(yè)學院3，湛江 524088)(廣東海洋大學深圳研究院4，深圳 518120)

抑郁癥是一種嚴重危害精神和生活質(zhì)量的常見疾病，是世界范圍內(nèi)疾病總負擔排名第3位的疾病。但是發(fā)病機制復雜且治療效果不佳，缺乏治療效果好且副作用小的抗抑郁藥物。近幾年“微生物-腸-腦軸”假說的提出為解決這一問題提供了一條新途徑和新方法。學者們認為腸道微生物與中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在雙向溝通[1]，如應激可導致腸道菌群失衡，結(jié)腸微生物組成發(fā)生變化[2]，進而導致“微生物—腸—腦軸”功能紊亂。研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物在抑郁癥患者和健康人群中存在明顯差異，在抑郁癥患者中發(fā)現(xiàn)梭菌屬和大腸桿菌的數(shù)量增加[3]，而雙岐桿菌屬和乳酸桿菌屬的數(shù)量下降[4]。實驗進一步證明雙岐桿菌可以減少母嬰分離的老鼠出現(xiàn)抑郁癥狀，可以改變老鼠體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平[5]具有類似抗抑郁劑的作用。因此，以改善腸道微生物作為核心來調(diào)整大腦為靶向的干預方法來預防和治療抑郁癥等神經(jīng)精神性疾病具有重要意義及應用前景。

我國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國，為稻谷碾白副產(chǎn)物米糠約占稻谷的12%，米糠資源十分豐富，但利用率極低[6]。海水稻是生長于海邊灘涂的一種耐鹽堿水稻新品種，其稻米外皮呈紫紅色，故也稱海紅米，素有“藥米”之美譽。研究發(fā)現(xiàn)海紅米的營養(yǎng)成分主要集中在米糠中，如膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素、多糖、脂肪酸、植酸和礦物質(zhì)等功能性成分[7]，且多種營養(yǎng)物質(zhì)含量都遠高于白米米糠[8, 9]；除此之外海紅米米糠比白米米糠含有更豐富的黃酮、阿魏酸、γ-氨基丁酸、六磷酸肌醇和生物堿等活性物質(zhì)[10, 11]，因而具有調(diào)控腸道微生物組成、發(fā)揮益生元功效、增強抗應激反應、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)功能和抗炎等生理功能[12-14]，但在精神類疾病如抑郁癥中鮮見報道。本研究采用國際公認的慢性不可預測溫和應激(CUMS)誘導抑郁癥動物模型，通過檢測小鼠的糖水偏好度和懸尾實驗的行為、腸道微生物、前額皮層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量來評價海紅米米糠在小鼠抑郁癥模型中的作用，為海紅米米糠在改善和治療神經(jīng)精神類疾病的保健品或藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

平均體重為25 g無特定病原體(SPF級)雄性成年C57BL/6種小鼠42只，(NO.1103222011 005888)。飼養(yǎng)于SPF級動物房(許可證號 SYXK(粵)2014-0053)，溫度(23±1) ℃，濕度(50±10)%，12 h光照(7:00-19:00)，自由攝食和飲水，實驗動物的飼養(yǎng)和操作規(guī)程均遵守實驗動物飼養(yǎng)和使用的相關(guān)規(guī)定，并通過實驗動物倫理審查(廣東海洋大學 IACUC-20200721-036)。海紅米米糠(國家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心華南中心)，QIAamp DNA Stool Mini Kit，熒光定量PCR儀，神經(jīng)遞質(zhì)標準品，高效液相色譜，SYBR Green熒光染料，Taq DNA聚合酶，瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與處理

將42只小鼠常規(guī)喂養(yǎng)7 d后隨機分為4組：對照組(CT，n=11)、應激組(CUMS，n=11)、海紅米米糠組(R，n=10)和應激+海紅米米糠組(CUMS+R，n=10)。海紅米米糠按照張瑛等[15]方法獲得，按5%質(zhì)量比的海紅米米糠均勻添加到粉末基礎(chǔ)飼料(配方如表1)中，充分均勻。小鼠自由攝取食物，參考Drescher等[16]給予每只小鼠6 g/d混合飼料或基礎(chǔ)飼料。

表1 小鼠基礎(chǔ)飼料配方

1.2.2 抑郁動物模型的建立

采用本實驗室[17]CUMS模型建立的方法。應激源的設(shè)置：200 r/min搖床1.5 h，缺水并空水瓶過夜，缺食過夜，濕墊料過夜，束縛1.5 h，18 ℃游泳10 min，鼠籠傾斜45°過夜，異味過夜，單籠過夜，頻閃燈過夜，光照過夜，4 ℃環(huán)境1.5 h，擁擠3 h。每天隨機給予2種不同的應激源刺激，且3 d內(nèi)不重復，應激周期為63 d。動物處死后，將腸道表面消毒后，迅速分離結(jié)腸中的糞便，裝入無菌EP管保存。剝離全腦，在冰上快速分離出前額葉皮質(zhì)組織，均快速置于-80 ℃保存。具體實驗流程如圖1所示。

圖1 具體實驗流程圖

1.2.3 糖水偏好實驗

前期已報道小鼠的快感缺乏程度可以采用糖水偏好度來評價，糖水偏好度越低說明抑郁程度越深，具體操作按照Li 等[18]的方法。

1.2.4 懸尾行為學實驗

小鼠在懸尾實驗中，為了克服不正常體位而企圖逃脫但又逃脫不了，從而放棄掙扎，該狀態(tài)稱為“絕望狀態(tài)”。具體操作按照Gu等[19]的方法，記錄小鼠在5 min 內(nèi)放棄身體掙扎的總時長。

1.2.5 實時熒光定量PCR

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒從小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中提取微生物DNA。具體操作步驟參照劉濤[20]的方法。

標準曲線：以拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，PCR反應過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標繪制標準曲線。乳桿菌的標準曲線方程為y=-2.800 7x+42.679，R2=0.989 4；雙歧桿菌的標準曲線方程為y=-3.685 4x+48.732，R2=0.989 4；梭菌的標準曲線方程為y=-3.738 7x+45.494，R2=0.995 1；大腸桿菌的標準曲線方程為y=-3.472 6x+46.17，R2=0.988 7。相關(guān)系數(shù)均達到了0.95上，可以作為日后檢測的標準。

表2 qPCR引物序列[21, 22]

1.2.6 小鼠前額葉皮質(zhì)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的提取及測定

前額葉皮質(zhì)是情感整合和認知的高級中樞，負責執(zhí)行認知過程的加工，參與控制情緒及沖突行為。按照本實驗室方法[18]進行神經(jīng)遞質(zhì)的提取及測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 海紅米米糠對應激誘導小鼠快感缺乏的改善作用

與對照組相比，慢性應激可顯著增加小鼠的快感缺乏程度(P<0.01)；而相比應激組，同時喂食海紅米米糠組可逆轉(zhuǎn)應激誘導小鼠的快感缺乏行為(P<0.01)，表明海紅米米糠對應激誘導小鼠的快感缺乏有逆轉(zhuǎn)作用。

2.2 海紅米米糠逆轉(zhuǎn)應激誘導的小鼠絕望放棄行為

與對照組相比，慢性應激可極顯著增加小鼠的絕望放棄行為(P<0.001)。而給予海紅米米糠干預后，可顯著逆轉(zhuǎn)應激誘導小鼠的絕望放棄行為(P<0.001)，這表明海紅米米糠對應激誘導小鼠的絕望放棄行為有逆轉(zhuǎn)作用。

2.3 海紅米米糠對應激誘導的小鼠結(jié)腸微生物數(shù)量的影響

如表3所示，與對照組相比，慢性應激顯著降低小鼠結(jié)腸中乳桿菌(P<0.01)和雙歧桿菌的數(shù)量(P<0.01) ，顯著升高梭菌(P<0.05)的數(shù)量，對大腸桿菌的數(shù)量沒有影響；而相比應激組，同時喂食海紅米米糠組小鼠結(jié)腸中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量(P<0.01)顯著增加，而對梭菌的數(shù)量有減少的趨勢。因此，海紅米米糠對應激誘導小鼠腸道菌群的失衡有改善作用。

表3 小鼠腸道微生物的數(shù)量變化

2.4 海紅米米糠對應激誘導的小鼠前額葉皮質(zhì)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的影響

由表4～表6可知，與對照組相比，應激組小鼠前額葉皮質(zhì)中的NE(P<0.01)、5-HT(P<0.05)、DA(P<0.05)及其代謝產(chǎn)物MHPG(P<0.01) 、5-HIAA(P<0.01)、DOPAC(P<0.01)的含量均顯著下降，而DA/ DOPAC比值顯著上升。而與應激組相比，喂食海紅米米糠組小鼠前額葉皮質(zhì)中的NE(P<0.05)、MHPG(P<0.05)和5-HT(P<0.05)的含量顯著上升。說明海紅米米糠對應激誘導的小鼠前額葉皮質(zhì)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的功能紊亂有改善作用。

表4 去甲腎上腺素和其代謝產(chǎn)物及比值的變化或6)

表5 五羥色胺和其代謝產(chǎn)物及比值的變化

表6 多巴胺和其代謝產(chǎn)物及比值的變化

3 討論

臨床研究表明持續(xù)性的慢性應激是引發(fā)抑郁癥的主要誘因。我們和其他學者的研究顯示給予動物慢性持續(xù)性應激刺激，表現(xiàn)出明顯的糖水偏好度降低、焦慮，以及產(chǎn)生絕望無助情緒等抑郁樣行為[18]。因此，慢性應激常用于抑郁模型的建立。本實驗行為結(jié)果顯示CUMS顯著降低小鼠的糖水偏好度，延長絕望放棄時間，說明利用CUMS方法成功建立了小鼠抑郁樣模型。海紅米米糠干預顯著改善由應激引起快感缺乏和絕望放棄的行為。同時本實驗表明慢性應激誘發(fā)小鼠抑郁樣行為與腸道細菌失衡密切相關(guān)。CUMS可使小鼠結(jié)腸中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量顯著下降，而增加了與炎癥相關(guān)的微生物種類如梭菌的數(shù)量，前人也發(fā)現(xiàn)使小鼠腸道菌群失衡可出現(xiàn)抑郁樣行為[23]。這與本研究團隊多年證明的抑郁癥免疫炎癥假說相符[24]：應激刺激引發(fā)炎癥過程， 促炎因子增加能激活血腦屏障中的某些轉(zhuǎn)運機制，從血腦屏障滲漏區(qū)釋放促炎細胞因子使其進入大腦最終導致抑郁癥的發(fā)生[25]。喂食海紅米米糠后，CUMS小鼠腸道菌群得到改善，這與海紅米米糠富含營養(yǎng)物質(zhì)如膳食纖維、微量元素以及多種生物活性物質(zhì)，促進乳桿菌、雙歧桿菌等優(yōu)勢菌屬的生長，并能發(fā)揮益生元的作用有關(guān)[13, 14]。膳食纖維作為益生元之一，可以改善腸道微生物的組成[26]，增加攝入量可顯著降低抑郁癥的發(fā)病風險。還有研究發(fā)現(xiàn)黃酮能有效促進腸道中有益菌的增殖，減少致病菌，調(diào)節(jié)腸道菌群[27]。因此，本實驗進一步證明腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著雙向調(diào)節(jié)。

本實驗中，小鼠經(jīng)歷CUMS后，前額葉皮質(zhì)中的5-HT、NE和DA及其代謝產(chǎn)物的含量均顯著降低，這與抑郁病人的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成和代謝減少、功能低下假說相符。給予海紅米米糠治療后，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成代謝異常得到了顯著的改善。已有研究發(fā)現(xiàn)DA能和5-HT能神經(jīng)元功能降低可造成快感缺乏[28, 29]，而絕望和焦慮行為與5-HT能和NE能神經(jīng)系統(tǒng)功能低下相關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)多種腸道菌群如乳桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌等可產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)，通過血液透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后可顯著改善神經(jīng)遞質(zhì)水平，并引起情感相關(guān)的行為學改變[30-32]。研究還發(fā)現(xiàn)益生菌配方(瑞士乳桿菌R0052和長雙歧桿菌R0175)可以抑制慢性應激導致小鼠外周皮質(zhì)酮的升高，抑制下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸過度活躍[33]，改善中樞神經(jīng)遞質(zhì)缺乏來發(fā)揮抗抑郁作用[18]。除此之外，益生菌還能通過腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)與其受體酪氨酸激酶B (Trk B)信號通路來改善CUMS導致大鼠前額葉皮質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)缺乏，從而改善大鼠的抑郁樣行為[34]。而本研究在CUMS誘導的抑郁模型進一步證實了海紅米米糠通過調(diào)節(jié)腸道微生物與神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系，起到了抗抑郁的作用。

從精神營養(yǎng)角度，海紅米米糠富含的活性成分與改善抑郁的機制包括：1)γ-氨基丁酸(GABA)活性成分[9]，GABA具備改善抑郁、改善睡眠、提高免疫力、改善炎癥等多種生理功能。2)海紅米米糠富含阿魏酸，Zeni等[35]發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠穿過血腦屏障，通過調(diào)節(jié)單胺能神經(jīng)系統(tǒng)，減少小鼠尾懸和強迫游泳的不動時間，發(fā)揮抗抑郁的作用。3)海紅米米糠所含的總黃酮不僅可以調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，還能增加5-HT、NE、DA濃度，產(chǎn)生抗抑郁的作用[36]。

4 結(jié)論

本研究表明海紅米米糠可改善慢性應激誘導小鼠的抑郁樣行為，其改善作用與改善腸道微生物和腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量相關(guān)。本實驗為治療抑郁癥的藥物或保健品研發(fā)提供了可能性，但海紅米米糠的確切活性成分及調(diào)控作用更深層的分子水平機制仍有待研究。