高效液相色譜法測定畜禽肉中8種生物胺含量國家標準方法的改進

閔 盛，孫 群，汪 洋，戴 琴，王德玉，王 碩

(成都市藥品檢驗研究院,成都 610045)

生物胺是一類具有生物活性的低相對分子質量的含氮有機化合物的總稱,結構上可看作是氨中的氫原子被烷基、芳基或雜環(huán)基取代后生成的化合物。按結構可將其分為脂肪族胺、芳香族胺和雜環(huán)族胺;按組成成分可分為單胺、二胺和多胺;按揮發(fā)難易程度可分為揮發(fā)性胺、非揮發(fā)性胺[1-2]。常見生物胺包括組胺、酪胺、色胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、精胺和亞精胺等[3-4]。低含量的生物胺對人體細胞增殖分化、核酸功能調節(jié)等代謝活動有重要作用,但當積累過多生物胺或由遺傳、胃腸道疾病及酒精攝入導致體內胃腸道上胺氧化酶活性不足時,便會引起一系列疾病,如頭痛、腹瀉、高血壓及心悸等[5-6]。其中,組胺的毒性最強,酪胺次之;腐胺和尸胺會抑制組胺、酪胺代謝酶的活性,增強組胺、酪胺的毒性,其還會與食品中的亞硝酸鹽反應生成N-亞硝胺致癌物[7]。畜禽肉含有豐富的蛋白質,而蛋白質分解為其腐敗變質的特征,生物胺是蛋白質受到組織酶或微生物蛋白酶的作用分解得到的產物,鑒于生物胺的毒性,加強對畜禽肉中生物胺的檢測具有非常重要的作用。

目前文獻報道的生物胺的檢測方法主要有氣相色譜法[8]、離子色譜法[9]、高效液相色譜法[10-13]、高效液相色譜-質譜法[14-16]、電化學生物傳感器法[17]、薄層色譜法[18]、毛細管電泳法[19]、酶聯(lián)免疫法[20]、膠束液相色譜法[21]等。其中,高效液相色譜法使用較普遍,也被國家標準GB 5009.208－2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》[22]采用。國家標準方法需要進行多次提取、多次凈化、丹磺酰氯柱前衍生等步驟,操作較為繁瑣、耗時較長(約6 h),且對衍生條件要求比較苛刻,不適用大批量樣品分析。在此基礎上,本工作簡化了前處理條件,在保證結果準確的前提下大大提高了檢測效率,能較好地滿足實際檢測需要。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器;BP211D 型電子天平(感量0.01 mg);HZS-H 型水浴振蕩器;Milli-Q 型純水儀;e 5810 R型高速冷凍離心機;H H·S 1-Ni型電熱恒溫水浴鍋。

單標準儲備溶液:1 000 mg·L－1,取各生物胺標準品約10 mg,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解并稀釋至10.0 mL,搖勻備用。

混合標準溶液系列:取適量各生物胺標準儲備溶液,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液逐級稀釋至質量濃度分別為5.00,12.5,25.0,50.0,75.0,125,250 mg·L－1的混合標準溶液系列,搖勻備用。

內標溶液:1 000 mg·L－1,取1,7-二氨基庚烷標準品約10 mg,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解并稀釋至10.0 mL,搖勻備用。

丹磺酰氯衍生溶液:10 g·L－1,取適量丹磺酰氯,以丙酮溶解并定容,置于4 ℃冰箱避光儲存。

色胺、尸胺標準品的純度為99.3%;β-苯乙胺、酪胺、亞精胺標準品的純度為99.9%;腐胺標準品的純度為99.8%;組胺標準品的純度為100.0%;精胺標準品的純度為99.6%;1,7-二氨基庚烷標準品的純度為98.7%。

甲醇、丙酮、正己烷均為色譜純;其他試劑為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Phenomenex Kinetex 色譜柱(100 mm ×4.6 mm,2.6μm);柱溫30 ℃;檢測波長254 nm;進樣體積10μL;流量1.5 mL·min－1;流動相A 為甲醇,B為水,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.3 試驗方法

取絞碎樣品10 g,置于50 mL 具塞錐形瓶中,加入50 g·L－1三氯乙酸溶液20 mL、正己烷10 mL及內標溶液1.0 mL,混勻,渦旋提取15 min,超聲提取15 min,以8 000 r·min－1轉速離心5 min。取0.5 mL 上清液置于10 mL 比色管中,依次加入2 mol·L－1氫氧化鈉溶液100μL、飽和碳酸氫鈉溶液300μL、丹磺酰氯衍生溶液2.0 mL,振蕩混勻,于60 ℃反應15 min。取出比色管,加入100μL氨水,振蕩混勻,于60 ℃保溫15 min,以終止衍生反應。加入乙腈稀釋至5 mL,振蕩混勻,用0.22μm 濾膜過濾,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

和國家標準GB 5009.208－2016相比:①本方法以一次性加入三氯乙酸溶液并用渦旋和超聲相結合方法提取樣品,避免了分次提取渦旋時間長、上清液渾濁導致過濾時間長等問題;②同時加入三氯乙酸溶液和正己烷即可得到澄清上清液,省去了單獨除脂步驟;③凈化操作對測定影響不大,省去了用體積比1∶1的正丁醇-三氯甲烷混合溶液萃取凈化的步驟。

2.2 衍生方法的選擇

和國家標準GB 5009.208－2016相比,本方法直接以氫氧化鈉溶液和碳酸氫鈉溶液調節(jié)溶液酸度,然后加入丹磺酰氯衍生溶液衍生,以氨水終止反應,所得色譜圖中,雜質色譜峰對生物胺基本無干擾,且各生物胺的回收率均在80.0%以上,省去了吹氮除丙酮、乙醚萃取并氮吹至干等步驟。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

與傳統(tǒng)C18色譜柱相比,Phenomenex Kinetex色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)采用了新型核-殼技術,極大縮短了溶質傳質過程和運行時間,提高了分離度,8種生物胺可在20 min內完成分離,比常規(guī)檢測(約40 min)節(jié)約了近一半時間。

在最優(yōu)試驗條件下,可在約1.5 h內完成樣品分析,所得50.0 mg·L－1混合標準溶液和加標樣品溶液(加標量50.0 mg·L－1)的色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液和加標樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution and the spiked sample solution

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

取0.5 mL混合標準溶液系列,置于10 mL 比色管中,加入內標溶液25μL,按照試驗方法衍生并測定,以各生物胺的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標進行線性回歸,所得標準曲線的線性范圍為5.00～250 mg·L－1,其他線性參數(shù)見表2。

分別以3倍、10倍信噪 比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),所得結果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

由表2 可知,8 種生物胺的檢出限為4～21μg·kg－1,滿足GB/T 5009.208－2016 對檢出限的要求。

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法分析6 份加標樣品(加標量為1 mg),1 d之內完成測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),所得結果見表3。再連續(xù)測定4 d,所得測定值的RSD 見表3。

表3 精密度和回收試驗結果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

由表3可知,8種生物胺的回收率為80.4%～95.6%,日 內RSD 為1.9%～5.1%,日 間RSD 為2.3%～6.2%,滿足日常檢測要求。

2.6 樣品分析

按照試驗方法分析20 批畜禽肉樣品,結果見表4。

由表4可知,在20批樣品中,組胺均未檢出,精胺均有不同程度檢出,生物胺總量大于100 mg·kg－1的樣品有6批,說明該方法能用于檢測畜禽肉中8種生物胺。

表4 樣品分析結果Tab.4 Analytical results of the samples mg·kg-1

本工作在國家標準GB 5009.208－2016提供的高效液相色譜法基礎上,簡化了樣品提取、衍生化過程,省去了凈化操作,不僅使樣品分析時間從6 h縮短至1.5 h,而且還降低了樣品損失和試劑耗費成本,方法的檢出限、精密度和準確度均符合要求,可用于畜禽肉樣品的批量分析。