液液萃取聯(lián)合固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中膽酸、脫氧膽酸和脫氫膽酸的殘留量

曹 晨，王 敏，陳念念，謝婧荷，彭 雪，張庶冉，俞珉頡，郭德華

(上海海關(guān) 動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心,上海 200135)

膽汁酸是脊椎動物膽汁的重要成分,能夠促進腸道對脂肪的消化和吸收,并有助于去除血液和肝臟中不通過腎臟排泄的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)[1-3]。膽汁酸是一種新型的水產(chǎn)動物飼料添加劑,能有效改善水產(chǎn)動物對脂肪的利用,提高飼料轉(zhuǎn)化率,維護水產(chǎn)動物肝臟健康[4-7]。然而存在一些尚待解決的問題,如外源性膽汁酸的添加是否會抑制內(nèi)源性膽汁酸的分泌,外源性膽汁酸添加量的確定[8-10]以及可能引起的安全問題[11-12]等。2021年,韓國食品藥品安全部發(fā)布了2021上半年進口水產(chǎn)品重點管理對象,要求水產(chǎn)品中脫氫膽酸檢出量不得超過0.01 mg·kg－1。

目前國內(nèi)關(guān)于膽汁酸檢測的研究對象大多針對水產(chǎn)動物膽汁,而對于膽汁酸飼料喂養(yǎng)的水產(chǎn)動物,其肌肉組織中膽汁酸殘留量的研究未見報道。鑒于此,本工作以養(yǎng)殖魚為研究對象,以膽酸、脫氧膽酸、脫氫膽酸為目標(biāo)物,采用乙腈提取,液液萃取聯(lián)合固相萃取凈化,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定,內(nèi)標(biāo)法定量,以期為水產(chǎn)動物肌肉中膽汁酸的快速篩選和確證提供技術(shù)手段。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters TQ-S micro型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;Eppendorf 5810R 型離心機;VORTEX-GENIE2型渦旋混合器;Elmasonic P 型超聲振蕩器;Waters HLB固相萃取柱(60 mg,3 mL),使用前分別用3 mL甲醇、3 mL水活化。

單標(biāo)準儲備溶液:1.0 g·L－1,分別取0.010 g(精確至0.000 1 g)膽酸、脫氧膽酸、脫氫膽酸、膽酸-d4、脫氧膽酸-d4標(biāo)準品,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,搖勻備用。其他質(zhì)量濃度的標(biāo)準溶液均由此溶液用50%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液逐級稀釋制備。

混合標(biāo)準溶液系列:取適量的單標(biāo)準儲備溶液,以50%甲醇溶液逐級稀釋,配制成膽酸-d4、脫氧膽酸-d4質(zhì)量濃度均為100μg·L－1,膽酸、脫氧膽酸、脫氫膽酸質(zhì)量濃度分別為10,50,100,200,500μg·L－1混合標(biāo)準溶液系列。

膽酸、脫氧膽酸、脫氫膽酸、膽酸-d4、脫氧膽酸-d4標(biāo)準品的純度均大于99%。

甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫30 ℃;流動相A為水,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～2.0 min時,A由90%降至10%,保持2.0 min;4.0～4.1 min時,A由10%跳轉(zhuǎn)至90%;4.1～5.0 min時,A 由90%升至95%。流量0.5 mL·min－1;進樣量2μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負離子掃描方式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣為氮氣;噴霧電壓－3 000 V,錐孔電壓30 V;去溶劑氣溫度500 ℃;去溶劑氣流量600 L·h－1;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。其中,“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取魚肉樣品5.0 g于50 mL 離心管中,加入100μg·L－1混合內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL、乙腈20 mL,混勻后超聲提取10 min,然后以4 500 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,按照上述步驟重復(fù)提取一次。合并上清液,于40 ℃旋蒸至干。殘渣用50%甲醇溶液1 mL超聲溶解5 min,加入5 mL 正己烷混勻,以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,棄掉正己烷層。保留相過HLB固相萃取柱,用3 mL 水淋洗,抽干小柱后用3 mL 甲醇洗脫。收集前5 mL 洗脫液,于40 ℃氮吹至干,殘渣用50%甲醇溶液1 mL 溶解,過0.45μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

膽酸、脫氧膽酸和脫氫膽酸均微溶于水、略溶于乙醇,不能直接采用水溶解、提取。因此,試驗考察了常用提取溶劑甲醇、乙腈、50%甲醇溶液、50%(體積分數(shù),下同)乙腈溶液在提取不同時間(10,15,30 min)時的提取效果。結(jié)果顯示:提取溶劑為50%甲醇溶液、50%乙腈溶液時,回收率為60.0%～70.0%,低于甲醇和乙腈的(回收率大于80.0%)?？疾焯崛r間時發(fā)現(xiàn),超聲提取不小于10 min時,目標(biāo)物均能被完全提取(回收率大于80.0%)?？紤]到分析時間、后續(xù)凈化等,試驗采用乙腈提取樣品10 min。

試驗還比較了HLB 固相萃取柱和C18固相萃取柱對3種目標(biāo)物的凈化效果。結(jié)果顯示:與C18固相萃取柱相比,HLB 固相萃取柱的洗脫效果較好,目標(biāo)物的回收率均在80.0%～120%內(nèi),測定值的相對標(biāo)準偏差(RSD,n＝6)不大于15%。收集前1,3,5,6 mL 洗脫液,進一步考察洗脫液體積對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明,目標(biāo)物回收率隨洗脫液體積的增加而增加,當(dāng)洗脫液體積為5 mL,目標(biāo)物的回收率達到90.0%以上,說明目標(biāo)物已基本洗脫完全,繼續(xù)收集洗脫液至體積為6 mL,回收率沒有明顯提高。綜合考慮試劑用量及洗脫時間等因素,本方法選擇收集前5 mL洗脫液進行后續(xù)試驗。

采用以上優(yōu)化的條件分析時,整個前處理過程耗時20～30 min,滿足殘留檢測的要求。

2.2 流動相的選擇

比較了20 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈、甲醇-水體系作流動相時的色譜分離效果。結(jié)果顯示:以20 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈體系作流動相時,目標(biāo)物的色譜峰存在脫尾現(xiàn)象,且響應(yīng)值偏低;以甲醇-水體系作流動相時,雖然保留時間增加,但峰形較好、響應(yīng)值較高,3種目標(biāo)物均得到了良好分離。因此,試驗選擇以甲醇-水體系作為流動相。

在優(yōu)化的色譜條件下,0.01 mg·L－1各標(biāo)準溶液的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 膽酸、膽酸-d4、脫氫膽酸、脫氧膽酸、脫氧膽酸-d4 標(biāo)準溶液MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of standard solutions of cholic acid,cholic acid-d4,dehydrocholic acid,deoxycholic acid and deoxycholic acid-d4

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

在考察掃描方式時發(fā)現(xiàn),采用負離子模式可獲得較高的質(zhì)譜靈敏度,可能和膽酸、脫氧膽酸和脫氫膽酸為酸性化合物有關(guān)。以1.0 mg·L－1單標(biāo)準溶液為待測對象,采用流動注射方式進樣,在負離子模式下先進行母離子掃描,得到各目標(biāo)物的準分子離子,調(diào)節(jié)質(zhì)譜參數(shù),使母離子的豐度達到最大。再進行二級質(zhì)譜分析,選取豐度較大、干擾較小的兩對子離子作為定性、定量離子,再優(yōu)化毛細管電壓、碰撞能量和碎裂電壓等質(zhì)譜參數(shù),使各目標(biāo)物的準分子離子和特征碎片離子豐度達到最大,所得質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.4 定量方法的選擇

膽酸及脫氧膽酸均有相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物,而脫氫膽酸沒有,因其結(jié)構(gòu)與脫氧膽酸的類似,所以可用脫氧膽酸-d4作為其內(nèi)標(biāo)物來進行定量。試驗比較了采用內(nèi)、外標(biāo)定量時各目標(biāo)物的回收率和精密度。結(jié)果顯示:使用外標(biāo)法定量時,基質(zhì)效應(yīng)影響較大,回收率為60.0%～70.0%,測定值的RSD(n＝6)大于20%;當(dāng)使用內(nèi)標(biāo)法定量時,不僅檢出限滿足要求,而且不同魚肉中目標(biāo)物的回收率在80.0%～120%內(nèi),測定值的RSD(n＝6)不大于15%,顯著優(yōu)于外標(biāo)法的定量結(jié)果。因此,試驗選擇以內(nèi)標(biāo)法定量。

2.5 標(biāo)準曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準溶液系列,以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)進行線性擬合。結(jié)果顯示,各目標(biāo)物標(biāo)準曲線的線性范圍為10～500μg·L－1,其他線性參數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)Tab.2 Linearity parameters

鑒于我國還沒有水產(chǎn)品中這3種目標(biāo)物殘留量的規(guī)定,參考韓國對脫氫膽酸限值的規(guī)定(0.01 mg·kg－1),將這3種目標(biāo)物的檢出限和測定下限確定為0.003,0.01 mg·kg－1。采用陰性樣品加標(biāo)的方法驗證了以上數(shù)值,所得信噪比(S/N)分別達到了不小于3,10的要求。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對陰性巴沙魚、鱗鲀魚樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平進行6次重復(fù)測定,計算回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表3。

由表3 結(jié)果可知,3 種目標(biāo)物的回收率為82.2%～115%,測定值的RSD 為2.6%～14%,說明本方法的準確度和精密度均較好,符合殘留檢測的要求。

表3 精密度和回收試驗(n=6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n=6)

本工作以乙腈超聲提取魚肉中的膽酸、脫氧膽酸和脫氫膽酸,以液液萃取聯(lián)合固相萃取凈化樣品,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定殘留量,該方法檢出限低,精密度和準確度好,適合魚肉中相關(guān)物質(zhì)的定量檢測。