淋巴細(xì)胞激活基因-3 分子的生物學(xué)功能及應(yīng)用

李閏，鄭秀玉 綜述，王健 審校

國(guó)藥中生生物技術(shù)研究院有限公司第四研究室，北京 102600

免疫檢查點(diǎn)抑制劑為腫瘤治療提供了一種新的機(jī)制，程序性死亡蛋白-1（programmed death protein-1，PD-1）／細(xì)胞程序性死亡-配體 1（programmed deathligand 1，PDL1）通路是目前設(shè)計(jì)用于免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物開發(fā)的主要靶點(diǎn)，已在許多實(shí)體瘤和血液瘤中取得了較好的臨床效果，但該類藥物具有一定的耐藥性和不良反應(yīng)，目前的研究致力于開發(fā)新的抑制途徑，這些抑制途徑參與癌癥中的免疫調(diào)節(jié)［1］。淋巴細(xì)胞激活基因-3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3），是一種新興的可靶向抑制的免疫檢查點(diǎn)分子。LAG-3 分子與CD4 分子位于同一條染色體上，盡管兩種分子的氨基酸序列僅有20%的相似性，但其結(jié)構(gòu)特性有相同的胞外折疊模式。因此，LAG-3分子也可結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）分子，甚至具有比CD4 分子更高的親和力。LAG-3 表達(dá)于活化的人T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞，在炎癥或腫瘤環(huán)境中，LAG-3和PD-1、TIM3 等抑制性受體共同表達(dá)于T 細(xì)胞表面，導(dǎo)致T 細(xì)胞功能障礙。在許多惡性腫瘤中，LAG-3主要表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)Treg 細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3在腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤和其他腫瘤的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上的表達(dá)增加［2］，并且在小鼠中同時(shí)敲除LAG-3 和PD-1 較單個(gè)敲除腫瘤體積明顯減少，在卵巢腫瘤、黑色素瘤、淋巴瘤和多個(gè)骨髓瘤觀察到同樣的結(jié)果［3］。目前臨床上已有多種靶向LAG-3的藥物正在研發(fā)，LAG-3 已是腫瘤免疫治療中最有前景和潛力的靶點(diǎn)之一，本文旨在介紹LAG-3 的分子結(jié)構(gòu)及其配體，以及LAG-3 分子在多種疾病中的應(yīng)用及藥物開發(fā)。

1 LAG-3 的分子結(jié)構(gòu)

LAG-3 于 1990年被 Frederic Triebel 發(fā)現(xiàn)，2007年第7 屆國(guó)際人類白細(xì)胞分化抗原專題會(huì)議命名為CD223。LAG-3 位于人 12 號(hào)染色體（12p13.3），基因全長(zhǎng)6.6 kb，包括8 個(gè)外顯子，相對(duì)應(yīng)的cDNA 編碼含有498 個(gè)氨基酸的膜蛋白，成熟蛋白由470 個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為 51 295，PL 為 10.9［4］。LAG-3 分子是免疫球蛋白超家族成員［5］，為跨膜蛋白，包括胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段。

LAG-3 胞內(nèi)段包括3 個(gè)區(qū)域，第1 個(gè)區(qū)域含有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)；第2 個(gè)區(qū)域含有獨(dú)特的Kieele基序；第 3 個(gè)區(qū)域含有谷氨酸-脯氨酸（Glu-Pro，EP）重復(fù)序列［6］。LAG-3 胞外段含有 D1 ~ D4 四個(gè)結(jié)構(gòu)域，類型為 1 個(gè)Ⅴ區(qū)和 3 個(gè)C2 區(qū)［7］。Ⅴ區(qū)具有特異性，因?yàn)樵谄浣Y(jié)構(gòu)域的中間有1 個(gè)額外的環(huán)，還含有1 個(gè)異常的鏈內(nèi)“二硫橋”。該基因編碼2 個(gè)免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，因此，LAG-3 分子可能是通過(guò)一個(gè)預(yù)先存在的基因復(fù)制演變而來(lái)［4］。疏水性前導(dǎo)肽（28 aa）由外顯子Ⅰ（19 aa）和外顯子Ⅱ（9 ／ 50）編碼；胞外區(qū)由外顯子Ⅱ（41／50）、Ⅲ（101 aa）、Ⅳ（90 aa）、Ⅴ（92 aa）和Ⅵ（81 aa）編碼；跨膜區(qū)由外顯子Ⅴ（44 aa）編碼；外顯子Ⅷ（21 aa）為高電荷區(qū)。胞外區(qū)包括8 個(gè)半胱氨酸殘基和4 個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser，Thr）。用 EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ或XbaⅠ限制性內(nèi)切酶消化LAG-3 基因，發(fā)現(xiàn)與基因組克隆的限制性內(nèi)切酶圖譜一致，表明LAG-3基因以單拷貝基因的形式存在于人類單倍體基因組中［4］。LAG-3 分子可在轉(zhuǎn)錄水平被金屬蛋白酶ADAM10 和ADAM17 分子消化切割，使其胞外段從細(xì)胞膜表面脫落，釋放可溶性LAG-3 分子（soluble LAG-3，sLAG-3）［8］。

LAG-3 與CD4 分子有高度同源性。對(duì)LAG-3和CD4 的肽序列和外顯子 ／ 內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的比較分析表明，這兩種分子間密切相關(guān)，并且這兩種基因均位于12 號(hào)染色體短臂的遠(yuǎn)端。與LAG-3 相同，在CD4分子中，在結(jié)構(gòu)域1 與3 及2 與4 之間也存在顯著的內(nèi)部序列同源性［9］。

2 LAG-3 分子相關(guān)配體

2.1 Lag-3-MHCⅡ 1992年，Baixera 等通過(guò)細(xì)胞黏附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的LAG-3 可結(jié)合MHCⅡ分子，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)LAG-3 融合蛋白可結(jié)合表達(dá)MHCⅡ分子的B 細(xì)胞。MHCⅡ分子表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）和腫瘤細(xì)胞表面。sLAG-3 分子對(duì)MHCⅡ分子的親合力大于CD4［10］，在某些情況下，MHCⅡ分子優(yōu)先結(jié)合 LAG-3，并且 LAG-3 與MHCⅡ類分子的結(jié)合可阻斷CD4 與MHCⅡ分子的相互作用。通過(guò)突變分析檢測(cè)LAG-3 分子與MHCⅡ分子的結(jié)合力，發(fā)現(xiàn)LAG-3 的前2 個(gè)N-末端區(qū)域，即D1、D2 包括D1 結(jié)構(gòu)域上的凸起，對(duì)結(jié)合MHCⅡ類分子起重要作用［11］。胞內(nèi)段無(wú)尾LAG-3 突變體不與MHCⅡ分子相互作用，表明LAG-3 分子胞內(nèi)段保守的Kieele 基序?qū)εc下游信號(hào)分子的相互作用是必須的［12］。

LAG-3 與MHCⅡ分子的相互作用可抑制T 細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌，下調(diào)免疫應(yīng)答。盡管CD8+T 細(xì)胞不表達(dá)MHCⅡ分子，但LAG-3 阻斷對(duì)CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞同樣有效。使用兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的LAG-3 抗體，即不阻斷LAG-3-MHCⅡ相互作用的C9B7W 和強(qiáng)烈阻斷LAG-3-MHCⅡ相互作用的抗體28G10 進(jìn)行體外試驗(yàn)，評(píng)估LAG-3 抗體的功效是否依賴于阻斷LAG-3 與MHCⅡ結(jié)合的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種抗體間的T 細(xì)胞體外試驗(yàn)無(wú)顯著差異，表明LAG-3 靶向抗體的T 細(xì)胞增強(qiáng)活性與其破壞LAG-3-MHCⅡ相互作用的能力無(wú)關(guān)［13］。盡管CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞不與MHCⅡ分子相互作用，但LAG-3 依然抑制其功能。這些研究表明，LAG-3的免疫抑制功能可能由其他配體介導(dǎo)。

LAG-3 對(duì)T 細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用。LAG-3 在Treg 細(xì)胞表面表達(dá)，是產(chǎn)生IL-10 的Tregs 的候選表型表面標(biāo)記，人PBMCs 中的CD4+CD25-LAG-3+Treg細(xì)胞均能產(chǎn)生高水平的IL-10，并抑制B 細(xì)胞抗體的產(chǎn)生［14］；LAG-3+Treg 特異性表達(dá)早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因 2（early growth response gene 2，EGR-2），是誘導(dǎo) T細(xì)胞耐受的關(guān)鍵分子［15］。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者中，LAG-3+Treg 與疾病活動(dòng)成反比，尤其是RA 的有效治療導(dǎo)致LAG-3+Treg 水平升高，CD25+Treg 水平降低，提示LAG-3+在降低炎癥中起關(guān)鍵作用［14］。另外，有研究顯示，在頸動(dòng)脈狹窄患者中檢測(cè)到LAG-3+Treg 細(xì)胞明顯上調(diào)，表明LAG-3+Treg 亞群從早期即參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的炎癥過(guò)程。提示LAG-3+Treg 細(xì)胞下調(diào)炎癥反應(yīng)［16］。

2.2 LAG-3-FGL-1 2019年2月，WANG 等［17］發(fā)現(xiàn)了LAG-3 的另一種重要配體，即纖維樣蛋白1（fibrinogen-likeprotein 1，F(xiàn)GL-1）。FGL-1 屬于纖維蛋白原家族，與纖維蛋白原β 和γ 亞基的羧基末端氨基酸同源性高，但其不具有纖維蛋白凝塊形成所必需的血小板結(jié)合位點(diǎn)、交聯(lián)區(qū)和凝血酶敏感位點(diǎn)。FGL-1由 1 個(gè) coil-coil 結(jié)構(gòu)域（coil-coil domain，CCD）和一個(gè)類纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域（fibrinogen-like domain，F(xiàn)D）組成［18］。通過(guò)結(jié)構(gòu)域缺失研究，與LAG-3 結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)域?yàn)镕D［17］。在LAG-3 蛋白胞外段的4 個(gè)結(jié)構(gòu)域中，D3、D4 結(jié)構(gòu)域缺失不影響FGL-1 的結(jié)合，而單獨(dú)的D1 或D2 結(jié)構(gòu)域的缺失降低其結(jié)合活性，表明D1 和D2 均參與FGL-1-LAG-3 的相互作用；D1 結(jié)構(gòu)域中的單點(diǎn)突變（Y73F）先前被證明破壞MHCⅡ結(jié)合［12］，然而，這種突變并不影響FGL-1-Ig結(jié)合，表明FGL-1-LAG-3 與MHCⅡ-LAG-3 的結(jié)合機(jī)制不同。此外，LAG-3+T 細(xì)胞與C9B7W（結(jié)合LAG-3 D2 結(jié)構(gòu)域而不阻斷LAG-3-MHCⅡ相互作用的抗LAG-3 mAb）預(yù)孵育，導(dǎo)致FGL-1-LAG-3 結(jié)合完全被抑制。之后，用MHCⅡ融合蛋白染色的LAG-3+細(xì)胞，即使在FGL-1-Ig 過(guò)量100 倍的情況下，結(jié)合也無(wú)明顯減少。表明FGL1 以獨(dú)立于MHCⅡ的方式與LAG-3 相互作用，這種相互作用涉及FGL1 的FD 結(jié)構(gòu)域和 LAG-3 D1-D2 結(jié)構(gòu)域［17］。

FGL-1 mRNA 和蛋白表達(dá)于人正常的肝臟和胰腺組織中［19］。Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，與正常組織相比，包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌在內(nèi)的人類實(shí)體瘤中FGL-1 mRNA 表達(dá)上調(diào)，另外，高血清FGL-1 還與帕金森患者預(yù)后不良有關(guān)［17］。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GL-1 基因敲除腫瘤生長(zhǎng)顯著減慢，同樣，F(xiàn)GL-1 單抗可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。表明FGL-1作為L(zhǎng)AG-3 主要配體誘導(dǎo)T 細(xì)胞抑制功能和免疫逃避。此外還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL-1 基因敲除小鼠中白細(xì)胞數(shù)量顯著增加；FGL-1 抗體或LAG-3 抗體處理小鼠的CD4+或CD8+TIL 中的活化或功能標(biāo)記物［如CD69、LY6C、顆粒酶 B（granzyme B，GZB）、CD4 和 Fas］顯著增加。表明通過(guò)基因敲除或抗體阻斷沉默F(xiàn)GL1-LAG-3 相互作用，可刺激T 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中增殖和活化，促進(jìn)腫瘤免疫［17］。

2.3 Lag-3 的其他配體 LAG-3 可能還具有其他一些配體。已知LAG-3 被廣泛的糖基化，可與半乳糖凝集素-3（Galectin-3）相互作用。Galectin-3 是一種相對(duì)分子質(zhì)量31 000 的凝集素，可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié) T 細(xì)胞反應(yīng)［20］。LAG-3 對(duì) Galectin-3 體外抑制CD8+T 細(xì)胞IFNγ 的釋放是必須的，其在腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞上表達(dá)，可與腫瘤特異性CD8+T 細(xì)胞上的LAG-3 相互作用調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答［21］。

另一種可能以類似方式與LAG-3 結(jié)合的潛在配體是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凝集素（liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin，LSECtin），其是DC-SIGN 家族成員的細(xì)胞表面凝集素［22］。LSECtin 在肝臟中表達(dá)，并且在黑色素瘤組織中被鑒定出來(lái)，抑制抗腫瘤T 細(xì)胞應(yīng)答促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［23］。在黑色素瘤細(xì)胞中，LAG-3 與LSECtin 相互作用抗原特異性T 細(xì)胞釋放IFNγ。

這兩種潛在配體的存在可能拓寬LAG-3 對(duì)T細(xì)胞功能的影響，特別是關(guān)于LAG-3 對(duì)腫瘤微環(huán)境中CD8+T 細(xì)胞的內(nèi)在作用。另外，不能排除LAG-3還有其他配體存在的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3 結(jié)合中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的突觸核蛋白預(yù)形成的原纖維，與小鼠模型帕金森病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［24］。以上數(shù)據(jù)提示了LAG-3 其他相關(guān)配體的潛力，并提示了LAG-3分子可能在免疫系統(tǒng)之外的作用。

3 LAG-3 信號(hào)通路

目前關(guān)于LAG-3 完整的信號(hào)通路尚未確定，仍需進(jìn)一步研究。現(xiàn)有的關(guān)于LAG-3 的下游信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究表明，LAG-3 具有其他抑制性受體（inhibitory receptor，IR）所不具備的獨(dú)特的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，表明其可能具有獨(dú)特的作用方式。早期研究表明，在酵母雙雜交篩選中鑒定的LAG-3 相關(guān)蛋白（LAG-3 associated protein，LAP）可能與 EP 基序結(jié)合［25］。LAP可促進(jìn) LAG-3 與 CD3、CD4 和 ／ 或 CD8 在富含鞘糖脂的微結(jié)構(gòu)域（脂筏）內(nèi)的共定位［26］。共刺激分子被分割成脂筏，隨后形成免疫突觸，聚集信號(hào)分子以增強(qiáng)TCR 信號(hào)。雖然LAP 最初被假設(shè)為對(duì)LAG-3信號(hào)傳導(dǎo)起重要作用，但缺少EP 基序的LAG-3 突變體仍保留活性，表明其對(duì)LAG-3 的功能可能不是必需的［12］。

Kieele 基序是LAG-3 活性必需的1 個(gè)基序，該序列中的單個(gè)賴氨酸殘基（小鼠中的Lys468）是不可缺少的，并且在迄今測(cè)序的所有物種中均保守［12］。該基序似乎不存在于任何其他蛋白質(zhì)中，因此其可能介導(dǎo)一種尚未鑒定的信號(hào)分子或機(jī)制。闡明潛在的LAG-3 細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)機(jī)制仍是當(dāng)務(wù)之急。

LAG-3 與APC 相互作用可傳導(dǎo)雙向信號(hào)。LAG-3在人體內(nèi)有兩種存在形式：膜結(jié)合型LAG-3（membrane LAG-3，mLAG-3）和可溶性 LAG-3（soluble LAG-3，sLAG-3），兩者與DC 相互作用發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。正常情況下DC 保持耐受狀態(tài)，經(jīng)外來(lái)抗原刺激后分化為成熟DC，并通過(guò)MHCⅠ類或Ⅱ類分子將抗原提呈給初始T 細(xì)胞，使T 細(xì)胞增殖分化為CTL 或CD4+Th1 細(xì)胞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子募集效應(yīng)T 細(xì)胞遷移至腫瘤部位，維持其在腫瘤部位的長(zhǎng)期存在，發(fā)揮腫瘤殺傷活性。腫瘤細(xì)胞表面不表達(dá)共刺激分子缺乏T 細(xì)胞成熟的第二信號(hào)，并且腫瘤細(xì)胞可分泌IL-10和TGF-β 等細(xì)胞因子，抑制DC 成熟。有研究表明，某些腫瘤可引起DC 凋亡［27］，DC 凋亡可能阻斷了特異性抗腫瘤反應(yīng)的發(fā)生，這可能是腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的重要機(jī)制。體外致敏的DC 回輸體內(nèi)可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，在人類臨床應(yīng)用研究中具有一定潛力［28］。

表達(dá)在Treg 細(xì)胞上的mLAG-3 與MHCⅡ結(jié)合可抑制 DC 功能，通過(guò)抑制 FcγRγ 和 ERK 參與的免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）信號(hào)通路，募集含 SH2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase 1，SHP-1）導(dǎo)致 IL-12 分泌減少和 CD86下調(diào)，從而下調(diào)免疫應(yīng)答［29］。與DC 的反向信號(hào)機(jī)制相似，mLAG-3 與表達(dá)MHCⅡ類的黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)激活 MAPK ／ ERK 和 PI3K ／ Akt 生存途徑來(lái)抵抗Fas 介導(dǎo)的凋亡，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸功能［30］。不同的是，sLAG-3 與DC 相互作用激活免疫應(yīng)答。sLAG-3-MHCⅡ類相互作用與CD40L-CD40 相互作用一起參與了APC 在體外誘導(dǎo)IL-12 和IFNγ［31］，并誘導(dǎo) DC產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞因子。sLAG-3 作為免疫激活劑與腫瘤細(xì)胞抗原一起皮下給藥時(shí)，可激活DC 誘導(dǎo)抗原或腫瘤特異性CTL 和 CD4 Th1 反應(yīng)［32］。

4 LAG-3 藥物的開發(fā)及應(yīng)用

目前有4 種LAG-3 調(diào)節(jié)劑作為抗癌治療藥物進(jìn)入臨床，還有幾種正在臨床前開發(fā)中。最初的LAG-3驅(qū)動(dòng)的臨床試驗(yàn)集中在設(shè)計(jì)為APC 激活劑的IMP-321（prima biomed ／ immutep）上，另外已開發(fā)了 3 種不同的LAG-3 特異性單克隆抗體用于治療癌癥，即BMS-986016（Bristol-Myers squibb，全人 IgG4）、LAG525（Novartis，人源化 IgG4）和 MK-4280（Merck）。葛蘭素史克公司開發(fā)的第4 種抗LAG-3 拮抗單克隆抗體（GSK2831781）被設(shè)計(jì)用于在自身免疫性疾病患者中耗竭LAG-3+表達(dá)細(xì)胞，該藥物正在用于斑塊型銀屑病患者的臨床試驗(yàn)（NCT02195349），強(qiáng)調(diào)LAG-3 調(diào)節(jié)療法可能具有癌癥以外的應(yīng)用的作用。靶向LAG-3 的藥物臨床試驗(yàn)總結(jié)見(jiàn)表1（ClinicalTrials.gov）［3］。

表1 LAG-3 藥物研發(fā)近況Tab.1 Recent development of LAG-3 drugs

4.1 sLAG-3 作為癌癥疫苗佐劑的應(yīng)用 治療性癌癥疫苗旨在通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性免疫系統(tǒng)來(lái)治療癌癥。在臨床有效的癌癥疫苗開發(fā)中，最實(shí)際的目標(biāo)之一是鑒定能夠優(yōu)化疫苗效果的佐劑。在人類細(xì)胞中，LAG-3 作為可溶性分子，結(jié)合MHCⅡ類分子通過(guò)PI3K ／Akt 通路信號(hào)傳導(dǎo)激活抗原呈遞細(xì)胞，導(dǎo)致體內(nèi)抗原特異性T 細(xì)胞應(yīng)答增加。體內(nèi)LAG-3 轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞或由sLAG-3 融合蛋白與照射的腫瘤細(xì)胞一起，可誘導(dǎo)腫瘤消退和腫瘤細(xì)胞特異性CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答［33］。隨后，用乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface Ag，HBsAg）或可溶性抗原（soluble antigen，OVA）與sLAG-3 共同免疫小鼠，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比（不加sLAG-3），sLAG-3 與抗原聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)CTL 應(yīng)答，激活T 細(xì)胞，增強(qiáng)Th1 型細(xì)胞因子應(yīng)答，并顯著提高血清抗體滴度［34］。

LAG-3 可作為佐劑激活免疫應(yīng)答，用于癌癥疫苗的治療。LAG-3-Ig 與 Poly（I：C）作為一種新的佐劑組合可協(xié)同增強(qiáng)癌癥疫苗的治療效果。腫瘤相關(guān)抗原 P1A 單獨(dú)與 poly（I：C）或 LAG-3-Ig 佐劑聯(lián)合免疫可延緩P815 肥大細(xì)胞瘤腫瘤的生長(zhǎng)，但小鼠最終均被腫瘤殺死。然而，當(dāng) P1A 肽疫苗與 Poly（I：C）和LAG-3-Ig 一起治療小鼠時(shí)，預(yù)先建立的P815 腫瘤完全消退，所有小鼠均獨(dú)立存活。對(duì)小鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，P1A 和 Poly（I：C）與 LAG-3-Ig聯(lián)合佐劑處理的小鼠，大多數(shù)腫瘤組織發(fā)生壞死，壞死區(qū)域附近有大量CD4+和CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)［35］。因此，可溶性LAG-3 分子在癌癥疫苗的研發(fā)中作為佐劑具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)于sLAG-3 免疫增強(qiáng)的臨床研究主要集中在IMP321。IMP321 是一種可溶性二聚體重組蛋白，由與人 IgG1（LAG-3-Ig）的 Fc 部分融合的 4 個(gè) LAG-3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成。該融合蛋白最初旨在作為L(zhǎng)AG-3拮抗劑，但如今臨床開發(fā)更關(guān)注于其作為免疫佐劑用于激活A(yù)PC 的用途。IMP321 作為一種單藥，在晚期轉(zhuǎn)移性腎癌（renal cell carcinoma，RCC）（NCT-00351949）患者中進(jìn)行了第1 期劑量遞增試驗(yàn)［36］，結(jié)果顯示，IMP321 單藥治療顯著誘導(dǎo)表達(dá)CD28 的效應(yīng)記憶T 細(xì)胞，并具有一定的安全性和耐受性，為將該藥物與一線化療或其他免疫治療（如癌癥疫苗）結(jié)合以增強(qiáng)整體抗腫瘤活性提供了依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，評(píng)估了IMP321 在晚期胰腺癌患者和晚期乳腺癌的化學(xué)免疫治療試驗(yàn)。IMP321 在美國(guó)的第1 個(gè)臨床試驗(yàn)評(píng)估了 IMP321 聯(lián)合吉西他濱（1 000 mg ／ m2）作為一線治療18 例晚期胰腺癌患者的安全性?；熆烧T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡釋放抗原，而IMP321 可刺激DC 成熟，因此認(rèn)為這一聯(lián)合作用可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增和對(duì)腫瘤的識(shí)別。結(jié)果顯示，吉西他濱與IMP321 聯(lián)合，在所有劑量水平上均具有良好的耐受性，并且無(wú)嚴(yán)重不良事件，其T 細(xì)胞水平及DC 和單核細(xì)胞水平在治療前后無(wú)明顯差別［37］。后續(xù)研究可探索更高的劑量水平。此外，在33 名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者（NCT00349934）中評(píng)估了IMP321 與紫杉醇聯(lián)合使用作為一線化學(xué)免疫療法的應(yīng)用，結(jié)果顯示，患者在化療后第2 天，每2 周用紫杉醇與可溶性IMP321 進(jìn)行治療，每組患者皮下注射0.25、1.25 和6.25 mg IMP321。接受治療的患者群體未出現(xiàn)不良反應(yīng)，建議將每2 周1 次的30 mg 劑量用于Ⅱ期臨床試驗(yàn)，該劑量被證明最有效并且安全，與對(duì)照組相比（單獨(dú)的紫杉醇治療）有明顯的免疫學(xué)效果。表達(dá)MHCⅡ分子的 APC（單核細(xì)胞和 DC）、NK 和 T 細(xì)胞群體均出現(xiàn)明顯升高，并伴隨腫瘤體積減?。?8］。

將LAG-3-Ig 與分泌粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的腫瘤細(xì)胞免疫療法結(jié)合可刺激細(xì)胞和體液抗腫瘤免疫應(yīng)答，這種聯(lián)合療法可促進(jìn)分泌IFNγ 的CD8+T 細(xì)胞增殖，并在動(dòng)物血清中檢測(cè)到抗原特異性IgG1 體液反應(yīng)增加，可延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的存活期［39］。

4.2 LAG-3 在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用 LAG-3 分子作為免疫檢查點(diǎn)，在多種腫瘤中發(fā)揮免疫抑制作用。錯(cuò)配修復(fù)陽(yáng)性的肝轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌（liver metastases of colorectal cancer，LM-CRC）在腫瘤 T 細(xì)胞上表達(dá)抑制性受體的比例高于錯(cuò)配修復(fù)陽(yáng)性的原發(fā)性CRC，CD8+T 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例也高于錯(cuò)配修復(fù)陽(yáng)性的原發(fā)性CRC，抑制性受體LAG-3、PD-1、TIM3 和 CTLA4 在 LM-CRC 腫瘤 CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 輔助細(xì)胞和 ／ 或調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞上的表達(dá)高于正常個(gè)體。LAG-3 或PD-L1 的抗體阻斷增加了從LM-CRC 分離的腫瘤內(nèi)T 細(xì)胞對(duì)多克隆和自體腫瘤特異性刺激的增殖和效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生［40］。

相對(duì)正常組織而言，LAG-3 分子在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者的腫瘤組織區(qū)中高表達(dá)，LAG-3 分子的高表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞的效應(yīng)功能呈負(fù)相關(guān)［41］。此外，LAG-3 分子在非小細(xì)胞癌、黑色素瘤、HIV 等疾病中通過(guò)免疫抑制作用實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，用LAG-3 單抗封閉可提高免疫應(yīng)答。

BMS-986016（Relatlimab）是首個(gè)開發(fā)的抗LAG-3 mAb，目前正在各種臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估，包括實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤。Relatlimab 的Ⅰ／ Ⅱa 初始階段試驗(yàn)旨在研究該藥物單獨(dú)使用或與Nivolumab 聯(lián)合治療對(duì)晚期疾病的療效，近期數(shù)據(jù)表明，在黑色素瘤患者中Relatlimab 與Nivolumab 聯(lián)合使用可延長(zhǎng)生存期［42］。

4.3 LAG-3 分子在自身免疫病中的應(yīng)用 抑制性受體（inhibitory receptor，IRS）的表達(dá)對(duì)于控制免疫反應(yīng)是必要的，從而防止惡化的T 細(xì)胞活化和自身免疫的發(fā)生，LAG-3 作為負(fù)性調(diào)節(jié)物具有重要作用。因此，LAG-3 缺陷導(dǎo)致許多自身免疫模型中疾病的惡化。BALB ／ c-Aicda-／-是一種自發(fā)性自身免疫病的小鼠模型，由LAG-3 功能喪失突變導(dǎo)致，并且缺乏編碼PD-1 的基因，LAG-3 的缺失在小鼠中誘導(dǎo)致死性心肌炎。表明LAG-3 與PD-1 協(xié)同作用可預(yù)防小鼠的自身免疫［43］?；罨腡 淋巴細(xì)胞在許多自身免疫疾病和器官移植排斥中具有重要意義。因此，特異性地耗盡LAG-3+T 細(xì)胞可能導(dǎo)致靶向免疫抑制，因此制備了細(xì)胞毒性LAG-3 嵌合抗體（嵌合A9H12），其對(duì)LAG-3 蛋白表現(xiàn)出高度的親和力并在體內(nèi)外均成功刪除T 細(xì)胞應(yīng)答，與傳統(tǒng)免疫抑制劑相比，LAG-3 是一種有前途的治療靶點(diǎn)，用于消除可能導(dǎo)致更高治療指數(shù)的自身免疫疾病和移植［44］。在LAG-3敲除的非肥胖糖尿病（non obese diabetes，NOD）小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)LAG-3-／-表現(xiàn)出糖尿病進(jìn)程加速，CD4+和CD8+T 細(xì)胞胰島浸潤(rùn)增加和胰島內(nèi)增生［45］。因此，LAG-3 在自身免疫疾病和移植排斥反應(yīng)的治療上具有較高的潛力。

5 展 望

阻斷CTLA4 和PD（-L）1 取得的成功為腫瘤靶向免疫治療建立了新途徑。在過(guò)去的幾年中，LAG-3作為一種抑制性受體獲得了廣泛的關(guān)注，現(xiàn)時(shí)已開展的多個(gè)LAG-3 靶向藥物早期臨床研究初步結(jié)果顯示，靶向LAG-3 作為單藥療法或聯(lián)合抗PD-1 ／ 抗PD-L1 抗體藥物均展現(xiàn)出一定的安全性和抗腫瘤有效性，特別是聯(lián)合療法有望發(fā)揮協(xié)同增強(qiáng)作用。因此，開發(fā)針對(duì)LAG-3 靶點(diǎn)的藥物將為患者提供更新型、全面和有效的治療方案。

在腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域，CTLA-4、PD-1、LAG-3、Tim-3、TIGIT 這 5 個(gè)免疫檢查點(diǎn)，能抑制 T 細(xì)胞的增殖、活化和效應(yīng)功能，維持體內(nèi)的免疫穩(wěn)態(tài)。目前對(duì)PD-1 ／ PD-L1 通路抑制腫瘤發(fā)展的研究比較深入，LAG-3 作為新型靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究，目前關(guān)于LAG-3 的藥物研發(fā)均是以MHCⅡ分子為配體開展，臨床效果差強(qiáng)人意。其功能配體FGL-1 的發(fā)現(xiàn)為L(zhǎng)AG-3分子藥物的研發(fā)提供了新的思路，其必將成為腫瘤免疫治療中最有前景和潛力的靶點(diǎn)之一。