過氧化麥角甾醇衍生物對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

張宏宇 任文康 鄒宇 韓迎龍 楊宏艷 卜明 都曉輝 林宇

關(guān)鍵詞過氧化麥角甾醇衍生物;乳腺癌細(xì)胞;EP-3P;三陰性乳腺癌;遷移;侵襲;凋亡

全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020 年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226 萬例，超過了肺癌的220 萬例，已成為全球第一大癌癥[1]。雖然隨著化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等綜合治療手段的運(yùn)用，癌癥患者的病死率已大幅度下降，但我國(guó)仍約有7.82%的女性因乳腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡[2]。因此，探尋治療乳腺癌的有效藥物仍然是亟待解決的問題。

從天然產(chǎn)物中尋找抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或修飾，已成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。過氧化麥角甾醇（ergosterol peroxide，EP）是一種過氧化甾體類天然產(chǎn)物，廣泛存在于多種真菌中[3-4]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，EP可通過細(xì)胞毒性作用抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，EP 作為一種重要的活性先導(dǎo)化合物，其特有的5α，8α-過氧橋是關(guān)鍵藥效載體[8-10]。EP的C-3 位和C-17 位具有較大的結(jié)構(gòu)修飾空間，如Li 等[11]、Han 等[12]分別在EP 的C-17 位引入吲哚醌取代基和酰肼側(cè)鏈合成了新的化合物，并發(fā)現(xiàn)上述合成的化合物均可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡;再如Bu 等[13]發(fā)現(xiàn)，在EP的C-3 位引入氨基甲酸酯極性基團(tuán)對(duì)提升其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性至關(guān)重要。

紫杉醇是一種公認(rèn)的治療乳腺癌的藥物，其結(jié)構(gòu)中的C-13 側(cè)鏈與其抗腫瘤作用密切相關(guān)[14]。為進(jìn)一步推進(jìn)EP 結(jié)構(gòu)衍生化研究，篩選具有更強(qiáng)抗腫瘤活性的新化合物，本課題組前期以EP作為先導(dǎo)化合物，通過在其C-3 位羥基引入紫杉醇的側(cè)鏈（4S，5R）-3- 叔丁氧羰基-2，2-二甲基-4-苯基-1，3- 唑烷-5-甲酸，合成了全新的EP衍生物EP-3P（結(jié)構(gòu)見圖1）。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)初步考察EP-3P 對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，以期為乳腺癌治療相關(guān)藥物的開發(fā)研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括：Axio observer A1 型倒置顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司），SAFIRE2 型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司），Power/PAC3000 型電泳儀、Chemi-Doc MP型凝膠成像儀、FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑包括：EP-3P（由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)研究室提供，批號(hào)20211020，經(jīng)高效液相色譜法和核磁共振法檢測(cè)其純度均在98%以上），L-15 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司），重組胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜（DMSO）、MTT細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0038）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒（批號(hào)P0010）、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)1753025），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KGA512），Matrigel 基質(zhì)膠（美國(guó)BD 公司，批號(hào)356234），鼠源B 淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和兔源Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）、胱天蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）、活化的caspase-3（cleaved-caspase-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）8 種單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司），ECL發(fā)光試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，批號(hào)CW0049），其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的L-15 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、無CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究選用傳代6～10代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的影響

采用MTT 法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-231 細(xì)胞，胰酶消化后用L-15 完全培養(yǎng)基稀釋成2×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按100 μL/孔接種于96 孔板中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組（不加任何藥物處理培養(yǎng)的細(xì)胞，即0 μmol/L）、EP-3P 不同濃度組（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，藥物濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組平行設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔;并設(shè)置空白調(diào)零孔（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液）。分別在培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí)，每孔加入0.5mg/mL 的MTT 溶液10 μL，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4 h 后棄去MTT，再每孔加入150 μL DMSO振蕩30 min 溶解甲瓚結(jié)晶;然后采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處的光密度值，并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=[1-（給藥組光密度值-空白調(diào)零孔光密度值）/（空白對(duì)照組光密度值- 空白調(diào)零孔光密度值）]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.3 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力的影響

采用細(xì)胞劃痕法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過夜，然后采用無菌槍頭在垂直于板的橫軸方向劃出等寬的直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞3 次。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（0 μmol/L）和EP-3P不同濃度組（5、10、20 μmol/L，濃度根據(jù)“2.2”項(xiàng)下MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果和本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，下同），每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24 h 后，用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況，并拍照。利用Image J V1.8.0 軟件測(cè)定劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞的遷移愈合率：遷移愈合率（%）=（0 h 時(shí)劃痕面積-24 h 時(shí)劃痕面積）/0 h 時(shí)劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.4 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲能力的影響

采用Transwell 小室法進(jìn)行檢測(cè)。將Matrigel 基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照體積比1 ∶8 混勻后，按50 μL/孔的量加入到Transwell 小室上層。將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中，將Matrigel 烘干，然后棄掉多余的培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞，制成1.5×105 個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別給予0（空白對(duì)照組）、5、10、20 μmol/L的EP-3P（EP-3P不同濃度組）刺激，每個(gè)濃度組設(shè)置3 個(gè)平行組。然后分別取上述給藥后的細(xì)胞懸液100 μL 加入到Transwell 小室上層，下層中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基700 μL。將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后以4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結(jié)晶紫染色30 min 后，于倒置顯微鏡下觀察穿過基底膜的侵襲細(xì)胞。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)5 個(gè)視野，取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.5 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞，常規(guī)制備細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h后，按照“2.3”項(xiàng)下方法分組與給藥。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集、洗滌細(xì)胞，先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI 試劑各5μL，混勻，于室溫下避光反應(yīng)15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并通過Flow jo 10 軟件分析各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期分布的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-231 細(xì)胞，按照“2.5”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥、培養(yǎng)并收集。制備細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，離心（2 000 r/min，5 min）去除上清，加入70%冷乙醇500 μL，4 ℃固定過夜;用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3 遍，除去殘留的乙醇;加入500 μL 提前配制好的PI/RNase A染色液（臨用前PI 與RNase A染色液按9 ∶1 的體積比配制），37 ℃避光孵育30 min 進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并通過Flow jo 10軟件分析細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞中凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后，以8×105個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于直徑為60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（0 μmol/L）和EP-3P 不同濃度組（5、10、20 μmol/L）。藥物作用24 h后，每個(gè)培養(yǎng)皿加入PMSF 和RIPA 裂解液的混合液（PMSF 和RIPA裂解液的體積比為1 ∶100）500 μL，于冰上裂解細(xì)胞30 min，提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，并將蛋白高溫變性。取變性后的蛋白樣品30 μg，在80 V電壓下進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在300 mA恒流下將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h;加入內(nèi)參蛋白GAPDH一抗（稀釋比例1 ∶5 000）和目標(biāo)蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-C、caspase-3、cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9 一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST 緩沖液漂洗10 min×3 次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1 ∶3 000），室溫孵育2 h;以TBST緩沖液漂洗10 min×3 次，加ECL發(fā)光液，然后于凝膠成像儀中成像。用Image J V1.8.0 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，不同濃度EP-3P 作用于MDA-MB-231 細(xì)胞24、48、72 h 后，細(xì)胞的增殖抑制率均不同程度地升高，并呈一定的濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)。其中，除EP-3P 1.25 μmol/L組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 時(shí)的增殖抑制率外，其余各濃度EP-3P組細(xì)胞在藥物作用24、48、72 h后的增殖抑制率均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）。各組細(xì)胞的增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，EP-3P 10、20 μmol/L 組細(xì)胞的遷移愈合率顯著降低（P<0.01），EP-3P 5、10、20 μmol/L組穿過基底膜的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01），且均呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖2、圖3和表2。

3.3 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，EP-3P 5、10、20 μmol/L 組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P<0.05），且呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖4、表3。

3.4 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期分布的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，EP-3P 5、10、20 μmol/L組G0/G1期細(xì)胞占比顯著降低（P<0.05 或P<0.01），G2/M期細(xì)胞占比顯著升高（P<0.05 或P<0.01），且呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖5、表3。

3.5 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞中凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，EP-3P 5、10、20 μmol/L 組細(xì)胞中Bcl-2、MMP-9 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而Bax 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;EP-3P 10、20 μmol/L 組細(xì)胞中caspase-3、MMP-2 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而Cyt-C、cleaved-caspase-3 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見圖6、表4。

4 討論

EP 具有抗病毒、抗癌、抗真菌等藥理作用[15-16]。近年來，EP的抗腫瘤作用也逐漸受到研究者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，EP 可抑制17β-雌二醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖活性[17]。El-Sherif 等[5]首次從埃及樹脂靈芝菌絲體中分離得到EP，并發(fā)現(xiàn)其在體外可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的增殖。據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，EP可抑制乳腺癌細(xì)胞SUM-149、MDA-MB-231 的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并可抑制細(xì)胞中蛋白激酶B、細(xì)胞周期蛋白D1 和原癌基因c-Myc 調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。然而EP的抗腫瘤作用及機(jī)制尚不清楚。本課題組在前期藥物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，EP的衍生物EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（11.29±3.13）μmol/L，對(duì)正常人乳腺細(xì)胞CCD-1095Sk 的IC50 為（54.73±2.48）μmol/L;而EP 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的IC50 為（20.54±1.98）μmol/L。上述結(jié)果表明，EP-3P 對(duì)MDA- MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于EP，且其對(duì)正常乳腺細(xì)胞的毒性作用較弱。本研究中MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，EP-3P 作用后對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，還可有效抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有一定的濃度依賴趨勢(shì)。

Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，其在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中起著重要作用[19]。該家族中的Bcl-2 和Bax 蛋白分別具有抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，可通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來調(diào)控線粒體凋亡途徑[20]。在正常狀態(tài)下，Cyt-C 位于線粒體外膜，當(dāng)外膜通透性增加時(shí)，Cyt-C 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，引起caspase 級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，導(dǎo)致caspase-3 進(jìn)入活化狀態(tài)（即cleaved-caspase-3）;活化的caspase-3 可裂解細(xì)胞內(nèi)生物酶結(jié)構(gòu)中的天冬氨酸殘基肽鍵，使酶失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，EP-3P作用于MDA-MB-231細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞中Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)下調(diào)和Bax、Cyt-C、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果提示，EP-3P可能通過上調(diào)細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)、下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)，介導(dǎo)線粒體的內(nèi)源性途徑來誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

MMP-2 和MMP-9 是MMPs 家族的重要成員，可參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控。已有相關(guān)報(bào)道證實(shí)，MMP-2 和MMP-9 的高表達(dá)可能與乳腺癌的高轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，EP-3P 可以有效抑制MDA-MB-231 細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達(dá)，表明EP-3P 可能是通過抑制MMP-2 和MMP-9 表達(dá)從而影響MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，EP-3P 可通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性caspase途徑抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的增殖、遷移和侵襲，并可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果為后續(xù)研究EP-3P 抗乳腺癌作用機(jī)制提供了一定參考，但本研究?jī)H采用單一的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，有關(guān)EP-3P 對(duì)其他腫瘤細(xì)胞及其抗乳腺癌的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。同時(shí)，衍生物EP-3P 抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和凋亡的作用是否優(yōu)于其先導(dǎo)化合物EP，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。