海水入侵區(qū)含水層中原核微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征及其意義

桑石磊，黃柏強(qiáng)，王永智，劉華雪，許莉佳，張 晉

1. 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510535

2. 河海大學(xué)長(zhǎng)江保護(hù)與綠色發(fā)展研究院，水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098

3. 中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，新疆 烏魯木齊 830011

地下水是一種寶貴的飲用水資源，為我國(guó)近70%的人口提供飲用，95%以上的農(nóng)村人口主要飲用地下水，40%的農(nóng)田主要用地下水來(lái)灌溉[1]. 改革開(kāi)放40 多年來(lái)，社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和各種污染物的排放引起了地下淡水資源的缺乏[2]. 海水入侵再加上地下水需求的激增以及全球氣候變化、海平面上升等自然因素，進(jìn)一步加劇了地下淡水資源的短缺[3].特別是許多沿海地下含水層正面臨著人為污染[4]、地下鹵水[5]或過(guò)量抽取地下水[6]所導(dǎo)致的海水入侵作用等因素，嚴(yán)重威脅著地下水的安全. 雖然地下含水層大多是寡營(yíng)養(yǎng)的，但微生物幾乎是地下水環(huán)境中唯一的棲息者[7]. 研究表明，含水層是受微生物群落活動(dòng)影響的特殊的生態(tài)系統(tǒng)[8]，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)移、元素的生物地球化學(xué)循環(huán)和污染物降解作用密切相關(guān)[9].

研究[10-12]表明，微生物群落是地下水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分. 近年來(lái)，多種微生物參數(shù)，包括微生物群落、多樣性與理化特性的相互作用等，已被用來(lái)作為水質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo). 例如，為了尋找監(jiān)測(cè)地下水水質(zhì)的生物參數(shù)，Unno 等[13]分析了微生物類群與水文化學(xué)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)微生物組分析是監(jiān)測(cè)地下水健康的有效工具. Ye 等[14]比較了海底地下水不同采樣位置的微生物指紋圖譜，并選擇了一些潛在的細(xì)菌類群(如共生單胞菌等)進(jìn)行生物修復(fù). 為有效了解和保護(hù)淡水地下水，研究地下含水層微生物群落的組成和功能是十分必要的. 然而，在海水入侵地區(qū)，地下水中微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)組成還未得到深入刻畫(huà)，且其群落結(jié)構(gòu)與水文環(huán)境的相互作用關(guān)系仍不明確.

珠江三角洲地區(qū)供應(yīng)將近5 000 萬(wàn)人口的用水需求，但幾乎一半的含水層中地下水含鹽度超過(guò)1 g/L[15-16]. 盡管水資源豐富，但由于土壤和水污染[17]以及珠江口嚴(yán)重的咸水入侵問(wèn)題[18]，導(dǎo)致珠江三角洲一些地區(qū)地下水中總?cè)芙夤腆w含量甚至超過(guò)10 g/L[19]. 研究表明，地下水鹽度的來(lái)源是由全新世海侵作用遺留的古海水[20-21]. 為了提高對(duì)地下水的管理水平，學(xué)者對(duì)珠江三角洲含水層水文地球化學(xué)特征進(jìn)行了大量研究[21-22]，但對(duì)該地區(qū)地下水鹽度梯度下微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少. 事實(shí)上，在世界上大多數(shù)國(guó)家的水質(zhì)監(jiān)測(cè)中，對(duì)地下生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的研究一直都未得到充分重視[23]. 研究[24]表明，微生物是地下水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是評(píng)價(jià)地下水水質(zhì)不可缺少的參數(shù). 為有效地了解和保護(hù)地下淡水，對(duì)含水層微生物群落的組成和功能進(jìn)行調(diào)查研究很有必要.

對(duì)地下水微生物多樣性的研究技術(shù)包括常規(guī)的培養(yǎng)技術(shù)和基于DNA 的分子生物學(xué)研究方法[25]. 由于環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中絕大多數(shù)微生物無(wú)法在人工培養(yǎng)基中輕易培養(yǎng)，而基于DNA 的高通量測(cè)序方法在探索復(fù)雜環(huán)境中的微生物群落方面具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì). 為研究珠江三角洲地下水中微生物群落的多樣性和分類組成，采用下一代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)，從水文生態(tài)學(xué)的角度描述微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量之間的關(guān)系；通過(guò)對(duì)珠江三角洲地下水水質(zhì)空間變化和微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，分析地下水微生物群落對(duì)鹽度變化的響應(yīng)，以期為地下咸水中微生物群落結(jié)構(gòu)及其環(huán)境相互作用提供參考.

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)、樣品采集

珠江三角洲屬亞熱帶季風(fēng)氣候，氣候溫暖濕潤(rùn)，年均氣溫22 °C 左右，年均降水量1 600～2 000 mm，主要集中在4—10 月. 2017 年5 月，在廣州市中部和南部地區(qū)選擇22 個(gè)監(jiān)測(cè)井，包括5 個(gè)重度咸水監(jiān)測(cè)井(S)(TDS 濃度＞10 g/L，TDS 表示溶解性總固體)、5個(gè)中度咸水監(jiān)測(cè)井(M1)(3 g/L＜TDS 濃度＜10 g/L)、3個(gè)微咸水監(jiān)測(cè)井(M2)(1 g/L＜TDS 濃度＜3 g/L)和9 個(gè)淡水監(jiān)測(cè)井(TDS 濃度＜1 g/L).

為保證取得的地下水樣可以表征含水層中地下水的性質(zhì)，采樣之前均對(duì)監(jiān)測(cè)井進(jìn)行洗井工作，采用專業(yè)的地下水抽水泵并以小流量抽水洗井. 根據(jù)監(jiān)測(cè)井井管尺寸等信息計(jì)算管內(nèi)水體積，保證洗井過(guò)程抽水量大于管內(nèi)水體積的3 倍，以除去殘留在監(jiān)測(cè)井中的“死水”，待水體各項(xiàng)理化指標(biāo)(溫度、鹽度和pH)穩(wěn)定后再采集樣品. 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試的理化指標(biāo)主要包括溫度(temperature,T)、pH、電導(dǎo)率(electrical conductivity,EC)、溶解性總固體(total dissolved solids, TDS)、溶解氧 (dissolved oxygen, DO)和氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP)，測(cè)量?jī)x器為電導(dǎo)率儀(Orion 320C-01A, Thermo Scientific, USA). 地下水樣本都收集在無(wú)菌的10 L 塑料容器中，用于過(guò)濾收集微生物樣本，通過(guò)抽濾法在0.22 μm 的纖維濾膜上富集微生物，將濾膜保存于無(wú)菌離心管，封口膜密封后即刻存放在—80 ℃冰箱中備用；每個(gè)樣本再過(guò)濾500 mL，一式三份，用于理化分析. 所有樣品在運(yùn)輸過(guò)程中均保存在4 ℃的冰柜中，運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室立即處理.

1.2 理化性質(zhì)分析

理化分析參考Greenberg 等[26]的方法，為了減少水樣雜質(zhì)的干擾，在測(cè)試前，將水樣用0.45 μm 的濾膜過(guò)濾. 陽(yáng)離子(K+、Ca2+、Na+和Mg2+)濃度采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICAP 7600 ICP-OES,Thermo Scientific, USA)測(cè)試，陰離子(NO3—、Cl—和SO42—)濃度使用離子色譜儀(883 chromatograph,Metrohm, Switzerland)測(cè)定. HCO3—和CO32—濃度采用化學(xué)滴定法(DZ/T 0064.49—1993《地下水質(zhì)檢測(cè)方法》)檢測(cè).

1.3 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

將水樣按照試劑盒MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit (Qiagen/MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad,CA, USA)操作步驟進(jìn)行DNA 提取. 用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組DNA 的提取效果，用NanoDrop 2000(Isogen Life Science, the Netherlands)光度儀檢測(cè)DNA的純度和濃度. 利用原核微生物16S rRNA V4 區(qū)引物515FmodF(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806RmodR (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR 擴(kuò)增[27]. 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃下保存(PCR 儀，ABI GeneAmp? 9700 型). PCR 反應(yīng)體系：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L) 0.8 μL，下游引物(5 μmol/L ) 0.8 μL, TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL. 每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù). 按照NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?(New England Biolabs, Ipswich,MA, USA)標(biāo)準(zhǔn)流程建庫(kù)操作，將樣品送到上海美吉生物科技有限公司，采用Illumina HiSeq 2500 PE250 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行擴(kuò)增子文庫(kù)的測(cè)序.

利用Trimmomatic 軟件(V0.33)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾后，通過(guò)FLASH(V1.2.11)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，再利用Mothur 軟件對(duì)拼接后的序列進(jìn)行質(zhì)量控制及過(guò)濾[28]，得到有效的拼接片段. 過(guò)濾reads 尾部質(zhì)量值在20 以下的堿基，設(shè)置50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，則從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp 以下的reads，去除含N 堿基的reads；根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對(duì)reads 拼接(merge)成一條序列，最小overlap 長(zhǎng)度為10 bp；拼接序列的overlap 區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode 允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2.

采用 RDP Classifier algorithm 方法和 Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物種進(jìn)行注釋分類(設(shè)置閾值為70%)，將相似度高于97%的定義為一個(gè)OTU(operational taxonomic unit，OTU). α-多樣性計(jì)算：包括群落的多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener)、豐富度指數(shù)(Chao1)、均勻度指數(shù)(Heip)和序列的覆蓋度(Good's coverage)，使用Mothur 軟件完成計(jì)算[28]. β-多樣性的計(jì)算：比較樣本之間的相似性，在OTU 水平上利用Bray-Curtis 算法做PCoA 分析，用R 語(yǔ)言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖[29]. 通過(guò)Cytoscape v2.8.3 對(duì)不同樣本間的物種豐度信息進(jìn)行共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析[30]，相關(guān)性熱圖用R 語(yǔ)言制圖[29]，采用VIF(Variance inflation factor，VIF)分析去掉共線性環(huán)境因子，并進(jìn)一步使用Canoco 4.5 軟件進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(CCA). 該文涉及的所有原始序列已上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，其登錄號(hào)為SRP118856.

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落的豐富度和多樣性

該研究中，從22 個(gè)地下水樣品中共獲得814 701條基因序列，對(duì)所有樣品進(jìn)行抽平，共獲得1 427 個(gè)OTUs (97%的置信度)，OTUs 的數(shù)目為415～804 個(gè)，表明觀測(cè)到的微生物豐度在不同水體中存在差異. 微生物群落的Chao1 豐富度指數(shù)為650～1 047，Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)為0.32～0.60. 一般來(lái)說(shuō)，重度咸水監(jiān)測(cè)井(S)樣品包含的微生物群落的豐富度和均勻度指數(shù)高于淡水監(jiān)測(cè)井(F)樣品. 然而，微生物群落的豐富度和均勻度指數(shù)的最低值出現(xiàn)在微咸水(M2)樣品中.

Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)表明，含水層中微生物群落多樣性隨鹽度梯度發(fā)生顯著變化. 然而，微生物群落多樣性指數(shù)最高值出現(xiàn)在重度咸水(S)樣品中，而最低值出現(xiàn)在微咸水(M2)樣品中，多樣性指數(shù)的變化并不完全與鹽度梯度一致. 微生物序列的覆蓋度都在99%以上，表現(xiàn)出了較好的序列完整性.

2.2 微生物群落的組成

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，該研究中基因序列可以分為細(xì)菌和古菌兩大類，大多數(shù)的序列鑒定為細(xì)菌(見(jiàn)圖1). 具體來(lái)說(shuō)，共分屬于47 個(gè)原核微生物門(mén)類，大多數(shù)序列從屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria, 占比為50%～94%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes, 占比為3%～45%)、奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota, 占比為0～29%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria, 占 比 為 0～14%)、 廣 古 菌 門(mén)(Euryarchaeota, 占 比 為 0～13%)和 擬 桿 菌 門(mén)(Bacteroidetes, 占比為0～10%)，還有一些序列占比在1%～10%之 間， 包 括 Acidobacteria、 Chloroflexi、Gemmatimonadetes 和Ignavibacteriae. 從結(jié)果來(lái)看，古菌在咸水中占比更高，廣古菌群(Euryarchaeota)在重度咸水(S)樣品中占比更高，而奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)在高濃度咸水樣品中占比更高.

圖 1 微生物群落在門(mén)水平上的分布Fig.1 Microbial composition analysis based on taxonomic classification at the phylum level

占比最高的變形菌門(mén)在綱水平上主要為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，在重度咸水(S)、中度咸水(M1)、微咸水(M2)和淡水(F)監(jiān)測(cè)井樣品中分別為45%、30%、46%和38% (見(jiàn)圖1). 淡水微生物群落中β-變形菌綱在總序列中的占比高達(dá)34%，而在重度咸水樣品中其占比不超過(guò)2%. 與其他樣品相比，Epsilonproteobacteria 僅在中度咸水(M1)樣品中發(fā)現(xiàn). 此外，Deltaproteobacteria 在重度咸水(S)樣品中的豐度高于其他樣品，而Zetaproteobacteria 在所有樣品中的豐度都很低.

2.3 微生物群落在不同鹽度梯度上的變化

利用群落隸屬關(guān)系對(duì)含水層微生物群落進(jìn)行比較，探討微生物群落分布沿含水層鹽度梯度的空間變化(見(jiàn)圖2). 樣本間OTUs 網(wǎng)絡(luò)分析表明，相對(duì)于其他鹽度的含水層樣品，中度咸水(M1)和微咸水(M2)地下水樣品微生物群落結(jié)構(gòu)更相似. 因此，為了更加清晰地顯示微生物群落在鹽度梯度上的分布，把中度咸水(M1)和微咸水(M2)地下水樣品合并起來(lái)共稱為咸水樣品(M). 維恩圖展示了共有和獨(dú)有的OTUs 數(shù)量在3 個(gè)鹽度梯度上的分布(見(jiàn)圖2). 從22 個(gè)地下水樣品中產(chǎn)生的1 427 個(gè)OTUs 中可以看出，3 個(gè)鹽度差異的微生物群落之間共有的OTUs 占比高達(dá)59%(837 個(gè)OTUs). 此外，兩個(gè)樣品的微生物群落之間共有的OTUs 約占18% (257 個(gè)OTUs). 維恩圖結(jié)果顯示，不同鹽度的樣品之間有很多共同的OTUs，在一定程度上也說(shuō)明含水層中淡水和咸水之間存在流通和交換作用.

特別是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)在所有鹽度水體中占比都很高，微生物群落的相似性反映在屬水平的高豐度類群中，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter)和Unclassified Enterobacteriaceae(見(jiàn)圖3). 重度咸水(S)中的高豐度類群是甲烷球菌屬(Methanococcus)、Candidatus Nitrosoarchaeum和海洋桿菌屬(Marinobacter)，分別隸屬于奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)、 廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria).然而，在淡水樣品中占優(yōu)勢(shì)的類群是β-變形菌綱(Betaproteobacteria)，包括Norank Hydrogenophilaceae、Unclassified Methylophilaceae、 Denitratisoma 和Unclassified Rhodocyclaceae.

圖 2 樣本之間OTUs 網(wǎng)絡(luò)分析和維恩圖Fig.2 Network analysis of OTUs between samples obtained Venn diagram

圖 3 不同鹽度梯度下微生物群落(屬水平)的相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of microbial taxa (genus level) along the salinity gradient

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的相互關(guān)系

對(duì)微生物群落與主要環(huán)境因子進(jìn)行典型相關(guān)分析. 結(jié)果顯示，前兩個(gè)CCA 軸中的環(huán)境參數(shù)共同解釋了微生物群落組成差異的23.7% (見(jiàn)圖4)，TDS 濃度(r2=0.63，P=0.001)和TN 濃度(r2=0.8，P=0.001)對(duì)微生物分布的影響最強(qiáng)，而溫度是最弱的環(huán)境變量. Spearman 相關(guān)分析(見(jiàn)表1)表明，厚壁菌相對(duì)豐 度與ORP 及HCO3—、DO 濃度均呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05). 擬桿菌相對(duì)豐度與ORP、pH 均呈顯著正相關(guān)，與Fe2+濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，而α-變形桿菌相對(duì)豐度與TP 濃度呈顯著正相關(guān)(P＜0.05). β-桿菌相對(duì)豐度與HCO3—濃度呈顯著正相關(guān)，與Cl—、TDS 濃度均呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05). γ-變形菌綱相對(duì)豐度與TN濃度呈顯著正相關(guān)(P＜0.01). 在屬水平上，短小桿菌屬相對(duì)豐度與HCO3—、DO 濃度均呈負(fù)相關(guān)，不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度與HCO3—濃度呈負(fù)相關(guān)，假單胞菌屬相對(duì)豐度與ORP 及HCO3—、DO 濃度均呈負(fù)相 關(guān)(P＜0.05).

圖 4 微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的典范對(duì)應(yīng)分析Fig.4 CCA analysis between microbial community structure and environmental fact

表 1 水體樣品在不同分類水平上的微生物群落相對(duì)豐度與環(huán)境因子之間的Spearman 相關(guān)性分析Table 1 Environmental factors associated with variations of the microbial communities at the phylum/class or genus level in the four water samples

3 討論

3.1 微生物的豐富度和多樣性

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)水體鹽度梯度下微生物多樣性的研究主要集中在地表水系統(tǒng)[31-32]. 該研究揭示了地下水中原核微生物群落的豐富度和多樣性，這些原核微生物所在的地下環(huán)境具有復(fù)雜的地球化學(xué)性質(zhì)，可能發(fā)生了劇烈的生物地球化學(xué)過(guò)程. 由Chao1 和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)反映的微生物群落豐富度和均勻度沿鹽度梯度發(fā)生了變化，但變化并不明顯. 總體而言，在重度咸水(TDS 濃度＞10 g/L)中觀察到的微生物群落豐富度和多樣性最高，其次是淡水. 該研究結(jié)果與在海灣河口[33]和原始含水層[34]中觀察到的結(jié)果相反，他們認(rèn)為鹽度的增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌多樣性的減少，而在相對(duì)穩(wěn)定的波羅的海河口[35]， Shannon-Wiener多樣性指數(shù)沿鹽度梯度的變化不明顯. 在微咸水(1 g/L＜TDS 濃度＜3 g/L)樣品中發(fā)現(xiàn)微生物群落的豐富度和均勻度最低，也就是說(shuō)，雖然微生物多樣性并沒(méi)有完全遵循鹽度梯度變化規(guī)律，但在TDS 濃度＞1 g/L 的咸水中，微生物群落多樣性隨著鹽度的增加而增加[23,36-37]. 因此，微生物群落的α-多樣性與其所處的環(huán)境條件關(guān)系非常密切. 在環(huán)境波動(dòng)較大的水體環(huán)境中[33-34]，地下水中微生物的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)由秋冬季的3.22±0.28顯著變化為春夏季的1.31±0.35，這是由于營(yíng)養(yǎng)鹽、有機(jī)碳的輸入以及地下水位的強(qiáng)烈波動(dòng)，引起微生物群落多樣性在不同季節(jié)具有顯著性差異. 而在該研究中，地下環(huán)境條件相對(duì)比較穩(wěn)定，微生物的多樣性的變化并不明顯.

3.2 微生物的群落結(jié)構(gòu)

結(jié)果顯示，地下水中的優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，與其他研究結(jié)果[38-39]相似，而古菌的群落結(jié)構(gòu)主要是奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén). 值得注意的是，γ-變形菌綱豐富度在所有樣本中都比較高(見(jiàn)圖1). 一般來(lái)說(shuō)，海水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是α-或γ-變形菌綱，β-變形細(xì)菌在淡水中占優(yōu)勢(shì)[40-41]. 該研究中，與咸水樣品相比，淡水樣品中的β-變形菌綱占比相對(duì)較高. 在咸水中檢測(cè)到豐度較高的類群主要包括脫硫弧菌屬、甲烷球菌屬和海洋桿菌屬，在其他樣品中幾乎未檢出(見(jiàn)圖3). 脫硫弧菌屬和產(chǎn)甲烷球菌屬中存在豐富的異養(yǎng)厭氧微生物，表明樣品的氧化還原電位較低. 先前的地質(zhì)調(diào)查中就發(fā)現(xiàn)地層中有大量的甲烷氣體和臭雞蛋味的硫化氫氣體，表明含水層中存在微生物硫酸鹽還原和產(chǎn)甲烷作用[20]. 該研究中一些高濃度咸水樣品中檢測(cè)到的脫硫弧菌屬和甲烷球菌厭氧微生物，可能是地層中二氧化硫和甲烷氣體生成的微生物類群. 在咸水樣品中有豐度較高的海洋桿菌屬，是嗜鹽或者耐鹽性的物種，一般生存在海洋環(huán)境中[42]，而這些海洋物種序列很可能是在海水入侵的作用下被帶入海濱含水層. 在其他海濱土壤的研究中也發(fā)現(xiàn)了海洋物種序列[43]，研究者認(rèn)為很可能是由于海水入侵作用被帶入海濱土壤. 這也表明了海濱含水層是海洋與內(nèi)陸物種交換的重要場(chǎng)所，對(duì)微生物的地理分布起到一定作用[44].

較長(zhǎng)的水體停留時(shí)間和相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境有助于建立穩(wěn)定的土著微生物群落生態(tài)系統(tǒng)[39]. 咸水與淡水微生物群落組成差異較大(見(jiàn)圖3)，然而維恩圖結(jié)果(見(jiàn)圖2)顯示，不同鹽度水體之間存在大量共有的OTUs，表明咸水與淡水之間可能存在著緊密的流動(dòng)和交換聯(lián)系[20].

3.3 微生物群落與環(huán)境的關(guān)系

一般認(rèn)為，水生微生物群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空變化和分布是環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果. 該研究中，微生物群落與主要環(huán)境因子的典型相關(guān)分析表明，前兩個(gè)CCA 軸中的環(huán)境參數(shù)共同解釋了微生物群落組成差異的23.7% (見(jiàn)圖4)，TDS 濃度(r2=0.63，P=0.001)和TN 濃度(r2=0.8，P=0.001)對(duì)微生物分布的影響最強(qiáng)，而溫度的影響最弱. 根據(jù)對(duì)不同生態(tài)環(huán)境的全球調(diào)查結(jié)果，鹽度被視為是微生物群落變異的主要環(huán)境影響因子[45-46]. 該研究結(jié)果表明，TDS 和TN 是微生物群落最有力的驅(qū)動(dòng)因素(見(jiàn)圖3). 鹽度是一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)境變量，它與β-變形菌綱豐度呈負(fù)相關(guān)，這與在黃海沿岸海底地下水中的研究結(jié)果[14]一致. 有研究[21]表明，珠江三角洲地下水體中存在高達(dá)8.6×109kg 的氨氮污染物，并且這些數(shù)量巨大的氨氮有機(jī)物從地下弱透水層不斷釋放，可以解釋TN 對(duì)微生物群落的重要影響. 根據(jù)廣東省水文地質(zhì)調(diào)查結(jié)果，珠江三角洲地下水中氨濃度高達(dá)560 mg/L，主要源于上覆的全新世-更新世中富含有機(jī)質(zhì)的含水層，通過(guò)地下水輸送擴(kuò)散進(jìn)入含水層[21]，可能會(huì)逐漸遷移到河水和沿岸海水中，破壞生態(tài)平衡，需引起高度重視.

4 結(jié)論

a) 珠三角地區(qū)海水入侵區(qū)含水層中原核微生物群落中細(xì)菌以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主，而古菌以奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén)為主，且古菌在咸水中豐富度更高.

b) 環(huán)境條件相對(duì)比較穩(wěn)定的含水層中，微生物多樣性變化并不明顯.

c) 該研究中對(duì)地下水微生物群落影響最大的環(huán)境因子是溶解性總固體(TDS)和總氮(TN)濃度，含水層中大量的氨氮可能會(huì)對(duì)生態(tài)平衡造成一定影響，需引起高度重視.