防己科地不容塊根淀粉形態(tài)與理化性質的研究

陳 曼， 陳歆蕊， 馮筱玥， 余徐潤， 熊 飛， 冉莉萍

(江蘇省作物遺傳生理重點實驗室/江蘇省作物栽培生理重點實驗室;揚州大學農學院；江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州大學1，揚州 225009)(揚州大學廣陵學院2，揚州 225128)

地不容(StephaniaepigaeaH. S. Lo)又名山烏龜，為防己科千金藤屬多年生藤本塊根類植物。地不容具碩大的肉質塊根，是我國南方的一種傳統(tǒng)中藥，可用于治療腮腺炎、胃潰瘍、白細胞減少癥等[1, 2]。目前，尋找新型植物淀粉資源在食品和非食品等各種工業(yè)的發(fā)展當中備受關注，因此，明確地不容淀粉形態(tài)和理化特征，將對開發(fā)地不容的淀粉資源具有重要意義。淀粉是塊根植物主要的碳水化合物，在塊根植物的生長過程當中，淀粉含量增加使其塊根生長膨大增粗[3]。研究表明，塊根或塊莖植物中的淀粉質量占干質量的30%～88%[4]。目前國內外對于塊根和塊莖類植物淀粉的研究主要針對馬鈴薯、木薯、芋頭、葛根等[5-7]，主要分析了這些淀粉的組成、分子結構、顆粒形態(tài)和晶體結構以及淀粉的糊化特性與老化特性等方面的性質[8]。有研究表明，馬鈴薯淀粉具有糊化溫度低、吸水量大、透明度高等特征[9]；木薯含有相對較高的直鏈淀粉，經(jīng)熬煮后不易成糊[7]。鑒于這些良好的理化性質，這些淀粉被廣泛用于食品或非食品方面，例如勾芡，做紡織勻漿，食品添加劑或粉絲、點心等各種食品的制作。然而有關地不容淀粉的理化性質的研究鮮有報道。目前地不容主要用于制藥，制藥后的殘渣常常被丟棄，造成資源的浪費，因此收集并研究地不容塊根淀粉的形態(tài)和理化性質意義重大。

本研究將從云南保山采購的地不容根莖當中提取淀粉，采用理化方法將地不容淀粉與已被廣泛研究和應用的小麥A-型淀粉、馬鈴薯B-型淀粉和豌豆C-型淀粉的特性進行比較，測定其淀粉的結構和功能特性，從而評價地不容淀粉的理化性質，為更好地利用地不容淀粉資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地不容塊根：云南省保山市，選取無病蟲害，飽滿且大小相近的塊根作為實驗材料；馬鈴薯塊莖：江蘇揚州；小麥品種“揚麥13”；豌豆為“中豌6號”；所用化學試劑均為分析純，所有試劑由蒸餾水制備。

1.2 儀器與設備

S-4800Ⅱ場發(fā)射掃描電鏡，Image-Pro Plus圖像分析軟件，D8 Advance 多晶 X射線衍射儀，AVANCE Ⅲ 400MHzWB 固體核磁共振波譜儀，Cary 610 /670 顯微紅外光譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 塊根顯微結構觀察

根據(jù)王忠等[10]的樹脂半薄切片法，從地不容中間部分進行橫切，使用雙面刀片在橫切面中心和外周皮處分別截取出2 mm×2 mm×3 mm的組織，立即置于2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液中，于4 ℃的冰箱中固定3 h。然后用磷酸鹽緩沖液(PH 7.2)洗滌樣品3次。樣品經(jīng)乙醇梯度脫水和環(huán)氧丙烷置換后，采用低黏性Spurr樹脂浸透與包埋，在70 ℃下聚合12 h。利用Ultracut R超薄切片機切出1 μm厚的薄片，經(jīng)0. 5%甲基紫染色5 min后于DMLS光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 I2-KI染色

選取新鮮地不容塊根，橫切成均勻的兩半，再用0.3% I2-KI溶液染色1 min，操作均在室溫下進行。用D3200數(shù)碼相機拍攝染色前后的塊根橫斷面。

1.3.3 淀粉分離

參考Peng等[11]的方法提取塊根淀粉，將豌豆與小麥種子用蒸餾水浸泡至8 h，新鮮的地不容塊根與馬鈴薯塊莖洗凈，分別制成漿液。將漿液與蒸餾水混合，并通過8層棉紗布過濾，用0.2%氫氧化鈉浸泡，4 000×g離心5 min，重復2次，去除蛋白質。最后用乙醇洗滌樣品，置于40 ℃烘箱烘至恒重，最后研磨并通過100目網(wǎng)篩，收集淀粉備用。

1.3.4 淀粉形態(tài)觀察及淀粉粒度分布分析

用2 mL 50%甘油分散5 mg淀粉顆粒。將淀粉分散液制成臨時裝片置于顯微鏡下。在DMLS光學顯微鏡下，在200×下觀察地不容、豌豆及小麥，100×下觀察馬鈴薯，并拍攝分散情況。選擇每種淀粉樣品的5～6張照片，使用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量淀粉顆粒的粒徑(經(jīng)顆粒中心的最大軸長)，每個樣品隨機統(tǒng)計2 000個淀粉顆粒，重復3次。

1.3.5 淀粉粒的掃描電鏡觀察

在1 mL乙醇中加入提取好的少量淀粉樣品，并震蕩均勻。在鋁箔包裹的載物臺上的樣品凹槽中滴 20 μL 的樣品溶液，等待樣品完全干燥。然后放入SCD500真空離子濺射儀中鍍金，之后在揚州大學測試中心場S4800發(fā)射掃描電子顯微鏡下拍攝1 000倍的照片并觀察。

1.3.6 總淀粉含量及可溶性糖含量測定

將樣品洗凈，用刀切成薄片，先至于40 ℃烘箱中脫去大量水分后，將烘箱溫度調至70 ℃烘箱烘干并研磨成粉，過100目篩。4種樣品的可溶性糖和總淀粉含量的測定參考Gao等[12]方法稍加修改。稱取50 mg淀粉于試管中，加入3 mL 80%乙醇后，水浴震蕩并離心，重復2次。合并2次提取的上清液于離心管中,加入適量活性炭在水浴震蕩，進行脫色后離心,用80%乙醇定容至8 mL，測定可溶性糖含量。往2次提取所剩余的殘渣中加入20 mL蒸餾水并轉移至50 mL容量瓶中，加入2 mL 9.2 mol/L高氯酸沸水浴15 min，過濾，再將上清液轉入容量瓶中，用蒸餾水定容，測定總淀粉含量。在2個容量瓶中各取溶液100 μL,加入3 mL新配制的蒽酮試劑，沸水浴10 min后室溫冷卻15 min，利用722分光光度計測定溶液在625 nm處的吸光度值，計算總淀粉和可溶性糖含量。

1.3.7 表觀直鏈淀粉含量的測定

稱取10 mg的淀粉樣品，向其中加入100 μL的95%的酒精將淀粉分散徹底，然后加入1 mL 1 moL/L NaOH的溶液，再用蒸餾水將混合液稀釋10倍，將稀釋后的溶液與0.1 moL/L的HCl中和，最后稀釋到0.25 mg/L的淀粉原液。吸0.2 mL的淀粉原液，向其中加入3.6 mL的蒸餾水和0.2 mL的KI/I2溶液(稱取1.6 g的KI溶解于20 mL的蒸餾水當中，再加入0. 2 g的I2，并將混合液混合均勻)，室溫下避光反應30 min后，分別在波長為510 nm和620 nm下測吸光值，計算表觀直鏈淀粉含量。

1.3.8 淀粉膨脹勢和溶解度的測定

參考Lu等[13]的方法測定淀粉膨脹勢和溶解度。稱取50 mg(m1)淀粉，加入稱重的離心管(m2)中，加入3 mL蒸餾水后在金屬浴中95 ℃加熱1 h，10 000 r/min離心5 min，棄出上清液后將沉淀與離心管一起稱質量(m3)，在40 ℃烘箱中烘至恒重(m4)，然后轉移到70 ℃烘箱中干燥，直至質量不變。膨脹勢和溶解度按公式計算。

膨脹勢(g/g)=(m3-m2)/(m4-m2)

溶解度=[m1-(m4-m2)]/m1×100%。

1.3.9 傅里葉變遠紅外光譜分析

稱取30 mg淀粉樣品，加入2 mL離心管中，然后加入25 uL超純水并旋渦振蕩調成乳液，然后將淀粉勻漿置于取樣器上，將超純水設為參照掃描背景，利用7000傅里葉變遠紅外光譜儀的衰減全反射(ATR)模式掃描淀粉樣品獲得波數(shù)為1 200～800 cm-1的原始光譜。根據(jù)Man[14]等的方法對原始光譜進行了解卷積，得到解卷積光譜。利用Image-Pro Plus 軟件對1 045、1 022、995 cm-1處峰的強度進行統(tǒng)計，并計算1 045/1 022 cm-1和1 022/995 cm-1的比值。

1.3.1013C固體核磁共振波譜(13C CP/MAS NMR)分析

利用AVANCE Ⅲ 400WB固體核磁共振波譜儀分析淀粉樣品。無定型淀粉以小麥天然淀粉在95 ℃下糊化1 h制得。以四甲基硅烷(TMS)作為化學位移的內標，并把它的化學位移定為零。使用PeakFit軟件對波圖進行波峰擬合，重復操作3次。參考Tan等[15]的方法計算出結晶峰、無定形峰、V-型單螺旋及雙螺旋所占的比值。

1.3.11 X-射線衍射分析

測試借助揚州大學測試中心的相關儀器。將淀粉樣品放置于儀器的樣品臺圓形凹槽中，壓片后在D8X-射線衍射儀上進行波譜掃描。衍射角2θ的旋轉范圍為4°～40°，步長0.6 s。獲得XRD波譜后，運用Photoshop CS6和Image Pro Plus計算樣品的相對結晶度(RDC)。

RDC=結晶峰面積×100%/(結晶峰面積+無定型峰面積)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)的測定經(jīng)過3次重復，結果以平均值±標準差表示；采用Origin 2018軟件及Photoshop CS6作圖；采用IBM SPSS Statistics 22.0的單因素 ANOVA 對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 塊根的形態(tài)及淀粉積累觀察

地不容塊根橫切面組織呈米白色(圖1a)。I2-KI溶液顯示米白色組織中大部分區(qū)域被染成紫黑色(圖1b)，說明地不容塊根組織有大量淀粉積累，且中間部位淀粉分布較多，邊緣分布較少。樹脂半薄切片顯示地不容塊根邊緣淀粉積累量較少(圖1c)，中間部分淀粉積累量較多(圖1d)，這與I2-KI組織化學染色結果相吻合。靠近表皮的部分，淀粉粒分散，細胞中淀粉粒間隙相對較大，而中間部分淀粉粒在細胞中分布相對較廣，間隙小，填充程度較高，且中間部分的淀粉粒徑明顯高于靠近皮層中淀粉粒粒徑。

注：a為塊根的橫切面；b為塊根I2-KI染色后橫切面；c、e為塊根表皮附近組織切片；d、f為塊根中間部位切片。標尺：a、b為1 cm，c、d為10 μm，e、f為50 μm。圖1 地不容塊根淀粉I2-KI染色及顯微結構圖

2.2 可溶性糖、總淀粉和直鏈淀粉含量及膨脹勢與溶解度

由表1可見，4種材料中地不容的總淀粉含量最低，明顯低于小麥和馬鈴薯，數(shù)據(jù)符合大多數(shù)塊莖淀粉的報告范圍[4]；地不容的可溶性糖含量較高，略高于小麥和馬鈴薯，但明顯低于豌豆；地不容直鏈淀粉質量分數(shù)為25.92%，明顯高于小麥和馬鈴薯淀粉，低于豌豆淀粉。4種不同類型淀粉膨脹勢由高到低為馬鈴薯>小麥>地不容>豌豆，溶解度為馬鈴薯>豌豆>小麥>地不容。

表1 不同材料總淀粉、可溶性糖、直鏈淀粉質量分數(shù)、膨脹勢及溶解度

2.3 淀粉粒的形態(tài)及粒度分布

圖2為4種淀粉的形態(tài)。馬鈴薯淀粉顆粒較大，形似其塊莖狀，較小的顆粒呈現(xiàn)卵圓形和圓形，表面光滑。豌豆淀粉粒呈現(xiàn)卵形，表面凹凸不平，但較為光滑。小麥淀粉顆粒扁平圓狀，表面光滑。地不容淀粉中較小的顆粒呈現(xiàn)球形，較大的顆粒呈現(xiàn)卵圓形，表面較少有裂紋。由結果可以看出，地不容淀粉的形態(tài)與其他淀粉形態(tài)較為相似。依據(jù)粒徑不同可將不同類型淀粉分為小顆粒(<10 μm)，中顆粒(10～30 μm)和大顆粒(>30 μm)3部分。從表2中可知，地不容淀粉粒群體中中顆粒淀粉的含量占比最多，淀粉平均粒徑明顯小于馬鈴薯淀粉和豌豆淀粉，但大于小麥淀粉，這與形態(tài)學觀察結果相符。

圖2 淀粉粒掃描電子顯微鏡圖片(標尺：50 μm)

表2 淀粉粒的尺寸

2.4 13C CP/MAS NMR分析

13C CP/MAS NMR可用于研究淀粉晶體結構組成。圖3a所示為4種類型淀粉的NMR波譜，可以看出，4種淀粉的波譜相似，在120～50×10-6區(qū)有4個明顯的峰值區(qū)域，包括C1、C4、C2，3，5和C6區(qū)域，但不同的淀粉主要在C1區(qū)域有明顯的區(qū)別(圖3b)。102.9×10-6處的無定形峰，是淀粉中直鏈淀粉和脂的存在而產(chǎn)生的，峰值的大小與淀粉的無定型區(qū)所占的比例成正相關[16]。小麥淀粉在C1區(qū)域的99.7×10-6、100. 5×10-6和101.8×10-6處有3個典型的結晶峰，在102.9×10-6處的無定形峰很明顯；馬鈴薯淀粉在C1區(qū)域100. 9×10-6和102.3×10-6有2個結晶峰，102.9×10-6處有1個不明顯的無定形峰；豌豆淀粉在99.9×10-6、100. 5×10-6和101.7×10-6處有3個結晶峰，103.6×10-6處有1個無定形峰；地不容在100. 4×10-6和101.7×10-6處有2個結晶峰，在101.9×10-6處有1個無定形峰。地不容淀粉的單螺旋與雙螺旋的比例分別為5.95%和28.51%(表3)，其單螺旋比例高于馬鈴薯，低于小麥與豌豆，而其雙螺旋比例高于馬鈴薯與豌豆，低于小麥。

表3 淀粉的無定型峰、V-單螺旋、雙螺旋比例、紅外光譜共振峰相對比值及相對結晶度

注：1～5分別表示地不容、碗豆、馬鈴薯、小麥、無定形。

2.5 淀粉的晶體結構

根據(jù)淀粉XRD圖譜的特征，可將淀粉分為A-，B-和C-型3種主要類型。A-型主要存在于禾谷類作物淀粉中； B-型主要存在于植物塊莖或塊根淀粉中；C-型淀粉由A-型和B-型組成，主要存在于豆類植物淀粉中[17]。小麥淀粉和馬鈴薯淀粉為公認的A-型淀粉和B-型淀粉(圖3c)。地不容淀粉和馬鈴薯淀粉均在5.6°附近出現(xiàn)一個弱峰，15°和22°附近出現(xiàn)中度峰，17°和24°附近出現(xiàn)較強的峰，這是典型的B-型晶體的特征，說明地不容同馬鈴薯一樣屬于B-型淀粉。地不容淀粉相對結晶度為21.20%(表3)，與馬鈴薯淀粉的相對結晶度無顯著性差異，但顯著高于小麥淀粉和豌豆淀粉。

2.6 淀粉顆粒表層結構有序度分析

由于ATR-FTIR光譜對分子構型及其螺旋結構的變化反應靈敏，因此可以用來定量分析和研究淀粉的結晶結構。圖3d所示為小麥、馬鈴薯、豌豆和地不容淀粉的ATR-FTIR光譜。由圖3可知，4種不同類型淀粉在波數(shù)1 200～800 cm-1間具有相似的共振峰，但在1 045、1 022、995 cm-1處有差別。1 045、1 022、995 cm-1處的峰分別與晶體結構、非晶體結構和水合碳水化合物螺旋有關[18]，所以淀粉粒共振峰相對強度的比值1 045/1 022 cm-1被認為是晶體/非晶體結構，用來衡量淀粉的結晶程度即有序度；1 022/995 cm-1被認為是非定形/水合碳水化合物螺旋，用來衡量淀粉中非定形碳水化合物結構與有序碳水化合物結構的比例[19]。表3所示為淀粉粒紅外光譜共振峰相對強度比值，4種材料中，地不容淀粉1 045/1 022 cm-1的比率最低，而1 022/995 cm-1的比率最高。該結果表明，地不容淀粉表面有序結構度最低，無定型區(qū)比例較多。

3 討論

分析防己科地不容塊根淀粉的積累特征及理化性質，組織化學染色表明，地不容的淀粉主要分布在塊根中部，這與其顯微結構觀察結果相同，符合前人研究甘薯塊根中淀粉積累特征[20]。雖然地不容的總淀粉含量較小麥、馬鈴薯、豌豆低，但依然接近50%，且可溶性糖含量高于小麥與馬鈴薯，說明地不容塊根是一種很好的淀粉來源[19]；可溶性糖參與調節(jié)植物細胞的滲透壓平衡，并對植物蛋白質穩(wěn)定的調節(jié)起重要作用[18]，對人體也有不可或缺的營養(yǎng)和保健作用，其塊根對人體也具有較高的營養(yǎng)和保健功能。

地不容淀粉表面較少有裂紋，這與Zhang等[19]的描述有差異，但其形態(tài)與馬鈴薯、豌豆和小麥淀粉的形態(tài)相似，較小的顆粒呈現(xiàn)球形，較大的顆粒呈現(xiàn)卵圓形。粒度分布的特征對淀粉的糊化、水解等功能性質有顯著影響，進而影響淀粉的加工和利用，是淀粉的重要性狀之一[21]。小麥淀粉當中存在兩種粒徑大小類型的淀粉粒，分別為A-型淀粉粒(1～10 μm)和B-型淀粉粒(10～35 μm)[11]，因此小麥淀粉粒度分布圖像為雙峰分布。地不容淀粉的粒度分布圖像呈單峰狀，與馬鈴薯淀粉、豌豆淀粉相似，而區(qū)別于小麥淀粉。將4種淀粉進行粒徑大小比較后發(fā)現(xiàn)地不容淀粉的粒徑明顯小于馬鈴薯淀粉和豌豆，但大于小麥，且淀粉顆粒中大部分分布于10～30 μm。形成該種差異結果的原因除了可能與其遺傳基因的表達有關，多數(shù)研究還表明，這可能與發(fā)育的時期、受到的空間擠壓和營養(yǎng)狀況等有關[22]。淀粉粒的形態(tài)和粒度分布可能影響淀粉的理化性質和相關的功能性質，由此推測，地不容除了不僅可以作為藥材，其淀粉也可用于食品加工。

從淀粉的分子結構上來看，支鏈淀粉的淀粉酶接觸位點較多，所以消化率較高，容易被人體吸收；相反，直鏈淀粉的淀粉酶接觸位點較少，不易被人體消化吸收。通過對各種植物的直鏈淀粉含量測定的數(shù)據(jù)可知，谷類的直鏈淀粉約占25%，豆類可達60%；在本實驗中，地不容直鏈淀粉質量分數(shù)雖然高于小麥及馬鈴薯直鏈淀粉，為25.92%，符合塊根植物的直鏈淀粉含量的范圍[4]。但在所有的淀粉植物中，其直鏈淀粉含量相對較少。直鏈淀粉較低的食品，其支鏈淀粉的含量相對較較多，所以地不容淀粉容易被消化吸收。淀粉顆粒表層結構有序度分析也表明地不容淀粉表面有序度最低，由于淀粉表層有序結構的比例很大程度上影響了淀粉的酸解性能，無定型結構相較于有序結構水解速率更快，水解程度更高[23]，地不容淀粉在食用后更容易被人體消化[24]。

馬鈴薯淀粉在4種淀粉中的溶解度和膨脹勢相對來說最大，因為馬鈴薯淀粉顆粒較大，在加熱的過程當中淀粉受到的內部張力較大，所以導致溶解度及膨脹勢也比較大[25]。Cai等[26]認為淀粉溶解度與淀粉中直鏈淀粉的含量呈正相關，本實驗中地不容的直鏈淀粉含量高于小麥淀粉和馬鈴薯淀粉，但地不容淀粉溶解度的值卻低于兩者，除了與淀粉的顆粒結構及淀粉粒徑大小的限制約束有關之外[27]，還可能是因為淀粉中的直鏈淀粉的含量越高，使淀粉之間有更強的抗拉伸力，從而使淀粉粒越緊實，水不容易在淀粉顆粒外充滿[28]，從而導致溶解度的值較低。

研究表明，單螺旋比例與直鏈淀粉含量成正相關，雙螺旋與支鏈淀粉含量成負相關關系[29]，且直鏈淀粉含量越高，無定形短鏈所占比例越大，從而導致淀粉相對結晶度越低[30]。本試驗中地不容淀粉的單螺旋與雙螺旋的比例分別為5.95%和28.51%，且相對結晶度為21.20%，高于小麥淀粉和豌豆淀粉的相對結晶度。地不容在100.4×10-6和101.7×10-6處有兩個結晶峰，在101.9×10-6處有一個無定形峰，這與Zhang等[19]相關研究相同，符合B-型淀粉的典型特征。在XRD波譜的分析當中，也驗證了這一點。

X-射線衍射是描述天然淀粉結晶特征的常用方法[4]。XRD波譜顯示地不容和馬鈴薯均在5.6°附近出現(xiàn)一個弱峰，15°和22°附近出現(xiàn)中度峰，17°和24°附近出現(xiàn)較強的峰，這是典型的B-型晶體的特征，說明地不容同馬鈴薯一樣屬于B-型淀粉，符合關于塊根及塊莖植物淀粉晶體類型的相關報道[18]。由于NMR和X-射線衍射測定的淀粉中的有序結構不同， NMR可以測淀粉中部分短程有序結構而XRD不能，所以NMR測定的相對結晶度比X-射線衍射測定的高，本研究結論也符合Atichokudomchai等[31]的相關結論。

4 結論

地不容塊根富含淀粉，主要集中在塊根中部，可作為良好的淀粉來源。地不容淀粉具有典型的B-型晶體的特征，與馬鈴薯類似。地不容具有直鏈淀粉含量較低，粒徑較小，膨脹勢和溶解度相對較低，淀粉表面有序度低等特點，使得地不容淀粉容易被消化吸收，可作為腸胃虛弱人群的輔食或應用個人護理用品領域，更好地開發(fā)利用不容制藥后的殘渣淀粉資源。