高效液相色譜-甲烷動(dòng)態(tài)反應(yīng)電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定谷物中痕量硒形態(tài)

周 婭，李 霞， 羅麗卉， 王 棚

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(成都),成都 610066)

硒是人體必需的微量元素，它是抗氧化防御系統(tǒng)和甲狀腺激素代謝過(guò)程的重要組成部分，并具有許多生理功能，例如免疫調(diào)節(jié)特性和對(duì)重金屬的拮抗作用[1-3]。人體不能自身合成硒，食物鏈?zhǔn)侨梭w中硒的主要來(lái)源。植物和動(dòng)物中的硒濃度基本上是由地質(zhì)決定的，但是硒在土壤中的分布極其不均勻，中國(guó)大約51%的土壤中缺乏硒[4]，在中國(guó)中度硒缺乏地區(qū)，每天主要的硒攝入來(lái)源是肉類和谷物，分別占67.8%和22.6%[5]，通過(guò)生物強(qiáng)化生產(chǎn)富含硒的作物是增加缺硒地區(qū)居民硒攝入的一種安全有效的方法[6]。

硒的代謝途徑、生物利用度、生理功能和毒性取決于攝入量和化學(xué)形式(物種)[7]。通常，硒的有機(jī)形式如硒代蛋氨酸(SeMet)，硒代半胱氨酸(SeCys)和甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)比無(wú)機(jī)硒具有更高的生物利用度和較低的毒性[8]?，F(xiàn)行食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法無(wú)法對(duì)硒的存在形態(tài)進(jìn)行定性和定量分析，因此硒形態(tài)分析對(duì)谷物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)及安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有至關(guān)重要的意義。

目前國(guó)內(nèi)外在硒形態(tài)研究方面已有一些報(bào)道，其中HPLC-ICP-MS和HPLC-AFS聯(lián)用技術(shù)是目前分析硒形態(tài)應(yīng)用最多的兩種方法。其中原子熒光檢測(cè)需要紫外光輻照，其形態(tài)轉(zhuǎn)化效率有待提高[9]；ICP-MS檢測(cè)對(duì)硒豐度較大的同位素存在明顯的多原子離子干擾(80Se豐度49.6%，但80Se易受到等離子氣40Ar40Ar+的同量異位素干擾，無(wú)法進(jìn)行測(cè)定)，現(xiàn)有文獻(xiàn)基本均采用氦氣碰撞降低部分干擾，只檢測(cè)同位素78Se(豐度23.77%)或82Se(豐度8.73%)，但靈敏度較低，檢出限較高，因此低硒樣品中硒形態(tài)由于含量低而無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而限制了檢測(cè)樣品類型的范圍[10-12]。本實(shí)驗(yàn)利用甲烷氣體消除質(zhì)譜干擾，測(cè)定豐度最大的同位素80Se，大幅度提高方法靈敏度，降低其檢出限，同時(shí)對(duì)前處理提取方法以及流動(dòng)相種類等條件優(yōu)化，建立了谷物中5種硒形態(tài)的測(cè)定方法，以期為谷物類食品中不同硒物種的測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒黑米、糙米、小米：市售。

硒單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)082114, 100 mg/L); 硒酸根Se(Ⅵ)(GBW10033, 75.1 μg/L)，亞硒酸根Se(Ⅳ)(GBW10032, 68.9 μg/L)、 硒代蛋氨酸SeMet (GBW10034,97.9 μg/L)、硒代胱氨酸SeCys (GBW10087, 93.5 μg/L)、甲基硒代半胱氨酸SeMecys (GBW10088, 96.6 μg/L);蛋白酶XIV; 檸檬酸、氨水、硝酸等其他化學(xué)試劑均為優(yōu)級(jí)純；色譜進(jìn)樣前所有樣品都經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。

1.2 儀器與設(shè)備

A-10型液相色譜儀，NexioN300D型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，TOPEX+微波消解儀，PRP-X100 陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 總硒前處理

參照 GB 5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》, 稱取0.5 g樣品置于消解內(nèi)罐中, 加入8 mL 濃硝酸，放入微波消解儀消解，消解完畢后，再以180 ℃趕酸至罐內(nèi)液體剩余1 mL左右，冷卻后用超純水少量多次定容至25 mL后上ICPMS, 同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 硒形態(tài)測(cè)定樣品前處理

稱取0.5 g(精確到0.001 g)， 溶解在10 mL Tris-HCl(100 mmol/L， pH7.4)中，加入蛋白酶XIV100 mg，在37 ℃下振蕩酶解12 h。酶解后，以8 000 r/min離心10 min，取上清液 ，過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC-ICP-MS測(cè)定，同時(shí)做樣品空白 。

1.4 儀器條件

液相色譜條件: PRP-X100 陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 流動(dòng)相 為 5 mmol/L 檸檬酸(pH5.0)，流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為100 μL。

ICP-MS 檢測(cè)條件: RF 發(fā)射功率 1 500 W；輔助氣流量1.2 L/min；等離子氣流量18 L/min；霧化器流量0.89 L/min；采樣錐：鎳錐；霧化器：同心玻璃霧化器。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲烷流量和反應(yīng)池抑制參數(shù)Rpq值優(yōu)化

Se在自然界中有74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se 6個(gè)同位素。74Se、76Se、77Se和82Se的豐度值較低，其信號(hào)值響應(yīng)低；78Se和80Se的自然豐度大，信號(hào)較強(qiáng)，但等離子氣體氬氣電離時(shí)產(chǎn)生的38Ar40Ar+、40Ca38Ar+、41K37Cl+、39K39K+、40Ar40Ar+都會(huì)產(chǎn)生同量異位干擾，使檢測(cè)硒的能力大大降低，導(dǎo)致檢出限變差，甚至無(wú)法直接測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)反應(yīng)池(DRC)技術(shù)來(lái)降低此類干擾，以期為硒檢測(cè)提供更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限。

動(dòng)態(tài)反應(yīng)池技術(shù)一般采用氧氣、氨氣、甲烷或者混合氣作為反應(yīng)介質(zhì)降低或消除某些元素的質(zhì)譜干擾。甲烷與80Se的主要干擾物40Ar40Ar+之間發(fā)生放熱反應(yīng)，并且具有較高的速率常數(shù)，故本研究采用甲烷作為反應(yīng)氣[13]。動(dòng)態(tài)反應(yīng)池技術(shù)主要由2個(gè)參數(shù)控制：反應(yīng)氣體流速和反應(yīng)池抑制參數(shù)(Rejection Parameter q，Rpq)，后者用作低質(zhì)量截止值，可以使得一定質(zhì)量數(shù)以下的離子被剔除，降低背景噪聲。本研究中反應(yīng)氣甲烷流量和反應(yīng)池抑制參數(shù)Rpq值對(duì)80Se信號(hào)強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖1(基質(zhì)空白為5 mmol/L檸檬酸，Se標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為1 μg/L)。隨著甲烷流量從0.2 mL/min逐漸增加至1.0 mL/min，基體背景信號(hào)逐漸降低最后趨于穩(wěn)定，當(dāng)甲烷流量為0.6 mL/min時(shí)80Se信號(hào)噪聲比最大；Rpq為0.5時(shí)，80Se信噪比最大。實(shí)驗(yàn)選擇甲烷流量為0.6 mL/min，反應(yīng)池抑制參數(shù)Rpq為0.5。

圖1 甲烷流量和反應(yīng)池抑制參數(shù)Rpq對(duì)基體空白和Se信號(hào)強(qiáng)度的影響

2.2 流動(dòng)相類型的優(yōu)化

陰離子交換色譜分離硒化合物常用流動(dòng)相包含緩沖鹽溶液(乙酸鹽，檸檬酸或磷酸鹽)和小部分(2%～5%)的有機(jī)改性劑(例如甲醇)[14-16]。本實(shí)驗(yàn)考察了磷酸氫二銨、乙酸銨、檸檬酸作為流動(dòng)相對(duì)5種硒形態(tài)的分離情況的影響。結(jié)果表明：10 mmol/L乙酸銨(pH 5.2)作為流動(dòng)相時(shí)，甲基硒代胱氨酸和亞硒酸根的峰形會(huì)發(fā)生重疊現(xiàn)象，不能有效分離；40 mmol/L磷酸氫二銨(pH 6.0)作為流動(dòng)相時(shí)基本能分離5中硒形態(tài)，但硒代蛋氨酸靈敏度低，硒酸根出峰時(shí)間為26 min，分離耗時(shí)較長(zhǎng)，信號(hào)強(qiáng)度較弱；5 mmol/L檸檬酸(pH 5.0)作為流動(dòng)相時(shí)，有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒分離效果較好(見(jiàn)圖2)，這與姚真真等[12]的研究結(jié)果一致。本研究選擇5 mmol/L檸檬酸(pH 5.0)作為流動(dòng)相，5種硒形態(tài)在20 min內(nèi)達(dá)到基線分離，且峰形與信號(hào)較好。

注：a流動(dòng)相為10 mmol/L乙酸銨(pH5.2)；b流動(dòng)相為40 mmol/L磷酸氫二銨(pH6.0)；c流動(dòng)相為5 mmol/L檸檬酸(pH5.0)。圖2 流動(dòng)相種類對(duì)硒形態(tài)分離的影響

2.3 樣品中硒形態(tài)提取條件的優(yōu)化

食品中硒形態(tài)的提取主要方式為液相萃取、液相微萃取和固相微萃取等[17,18]。提取過(guò)程中不同形態(tài)的硒很容易受到提取介質(zhì)的影響發(fā)生轉(zhuǎn)變或損失，因此從食品基質(zhì)中提取硒不同形態(tài)的技術(shù)關(guān)鍵在于能否顯著提高樣品提取效率。本研究對(duì)比了液相萃取中蛋白酶用量和提取時(shí)間對(duì)硒形態(tài)提取效率的影響。

本研究考察了富硒黑米中加入蛋白酶XIV20、40、60、80、100 mg時(shí)樣品的提取效率，結(jié)果見(jiàn)表1。研究結(jié)果表明：黑米樣品中5種硒形態(tài)主要檢出硒代胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)，蛋白酶XIV的加入量直接影響SeMet的提取量；加入蛋白酶XIV20 mg時(shí)，樣品的提取效率僅為39.0%，酶加入量增加后，提取效率顯著提高。加入100 mg時(shí)，提取效率能達(dá)到90%，所以本實(shí)驗(yàn)選擇加入100 mg蛋白酶XIV。

表1 蛋白酶XIV用量對(duì)硒形態(tài)提取效率的影響

本研究?jī)?yōu)化了不同提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響。分別研究了37 ℃振蕩提取時(shí)間 8、 12、 24、48 h對(duì)硒形態(tài)提取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)提取時(shí)間為8 h時(shí)，提取效率只有70%；當(dāng)提取時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，提取效率升高；當(dāng)提取時(shí)間為12 h和24 h時(shí)，提取效率變化不大，均達(dá)到了90%；提取時(shí)間為48 h時(shí)，有很大的雜峰，懷疑提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)硒形態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)變。本研究提取時(shí)間選擇為12 h。

2.4 線性關(guān)系及檢出限

使用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件進(jìn)行檢測(cè)，硒代胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMecys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸根Se(Ⅵ), 亞硒酸根Se(Ⅳ)的線性范圍為0.50～50 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999 9，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根的檢出限分別為0.01、0.05、0.05、0.20、0.10 μg/L，比相關(guān)研究的檢出限均低[10-12,19,20]。5種硒形態(tài)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見(jiàn)表2。

表2 5種硒形態(tài)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 方法回收率與精密度

選取富硒黑米樣品進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)。按 1.3.2 方法處理樣品，黑米中5種硒形態(tài)僅檢出了硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，其余形態(tài)均未檢出。對(duì)黑米樣品進(jìn)行低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn), 每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。 結(jié)果表明, 5 種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率88.5%～105.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～4.4%, 說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度(見(jiàn)表3)。

2.6 實(shí)際樣品分析

使用HPLC-DRC-ICP-MS方法分析了市售糙米、黑米、小米中5種硒形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷物中的硒含量差異較大，糙米和黑米中的硒成分以硒代蛋氨酸(SeMet)為主，含有少量硒代半胱氨酸SeCys，小米中硒的成分全部以硒代蛋氨酸(SeMet)的有機(jī)形態(tài)存在。使用本方法的提取程序，谷物樣品中有機(jī)硒含量占總硒含量的87.5%～91.5%，這說(shuō)明富硒谷物中含有豐富的有機(jī)硒成分，可作為良好的補(bǔ)硒產(chǎn)品。

表3 黑米中5種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

表4 市售谷物中的5種硒形態(tài)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

利用恒溫振蕩輔助酶萃取進(jìn)行樣品前處理，建立了HPLC-DRC-ICPMS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定谷物中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根5種常見(jiàn)硒形態(tài)的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、精密度和準(zhǔn)確度良好，為各類谷物樣品中的硒形態(tài)分析提供了一種簡(jiǎn)單而靈敏的測(cè)定技術(shù)。