可視化微觀顯影對二氧化碳膨脹乙醇提取葡萄籽油的過程分析

黃林潔, 謝雨波, 李紅娜, 李明越, 周 丹, 鄧 剛

(浙江省特色經濟植物生物技術研究重點實驗室；浙江師范大學化學與生命科學學院，金華 321004)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界范圍內廣受歡迎的大宗水果之一，全球年消費量接近8 000萬t，其中80%以上的葡萄被用于生產葡萄酒、果醬等，產生葡萄籽約300萬t[1]。葡萄籽殘渣除了可用于土壤改良劑和飼料外，還是一種理想的油脂提取原料。葡萄籽富含油脂[2]，不飽和脂肪酸高達85%[3]，其主要成分亞油酸是人體必需脂肪酸[3]。傳統(tǒng)葡萄籽油的提取方法有機械壓榨法、有機溶劑萃取法[3]等，設備成熟、操作快捷、工藝簡單，但存在能耗高、溶劑使用量大等缺點。近年來，隨著可持續(xù)發(fā)展政策的推進，發(fā)展綠色經濟已經成為一個重要趨勢，Li等[4]對一種新型環(huán)境友好型提取溶劑，二氧化碳膨脹乙醇(CO2-Expanded Ethanol, CXE)進行了研究，優(yōu)化了提取葡萄籽油的操作條件，得率高達13.6%，提取效率及產品品質均優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法，可作為有機溶劑的替代介質[5]。

然而，CXE是一種復雜的加壓流體，由非極性的超臨界或亞臨界狀態(tài)的CO2和極性的乙醇混合組成[6，7]，其提取機理受多種因素影響，一方面，流體的溶解性能和滲透擴散能力易受溫度、壓力、CO2摩爾比等因素控制[8-10]，另一方面，高壓條件(40 MPa以上)下滲透到內部的流體可造成物料微觀結構碎裂或局部坍塌，進而促進或阻礙特定物質由內向外的釋放。因此，傳統(tǒng)方法如基于過程數據的動力學分析或基于模型的熱力學理論研究，用于闡述加壓流體的復雜提取機制均非常困難。近年來隨著光電子、圖像加工處理等技術的迅猛發(fā)展，使得對微細顆粒形態(tài)結構進行可視化顯影(visualization)成為可能，在食品加工、生物分離及植物生理等領域均有廣泛應用。以電子束為介質的掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM)技術，可在納米尺度上來研究微觀結構的變化，Khadhraoui等[11]用場發(fā)射掃描電鏡觀測到50 μm的苦橙葉腺體在超聲波作用下的破損狀態(tài)，Zhang等[12]通過聚焦離子束掃描電鏡觀察了蒸壓和超聲波處理后杏仁粉中粒徑15 μm的顆粒內部多孔化(cavitation)。進一步結合染色技術對物料內部特定物質染色后，借助熒光觀測進行定位分析，尤其是借助于以激光為光源的激光共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy, CLSM)對物料內部聚焦成像，能夠以非破壞性的方式觀察到內部三維空間結構中目標物質的動態(tài)變化和傳質過程，如蓖麻籽粉中的脂質體形態(tài)變化[13]、萵苣嫩莖中的果膠從細胞壁分解至細胞間隙[14]、刺梨果皮中的甜菜素和酚類化合物從細胞內部釋放到細胞間隙[15]。由此可見，微觀顯影技術可作為一種直觀的分析方法引入到加壓流體提取過程的研究中，追蹤目標成分在物料內部的空間分布，監(jiān)測傳質過程中的釋放機制，從而闡明提取機理，為傳統(tǒng)動力學、熱力學理論研究提供參考。

本研究在CXE提取葡萄籽油過程中，通過掃描電子顯微鏡觀測了提取前后葡萄籽物料內部的微觀結構，對內容物葡萄籽油進行了特異性染色，構建了熒光定量法對葡萄籽油提取的三階段進行了過程分析，利用激光共聚焦顯微鏡動態(tài)分析了提取過程中葡萄籽油的空間分布變化，并直觀地評價了不同提取方法的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

紅葡萄(Vitisvinifera)于2017年9月，在中國新疆省吐魯番市(43.15° N，88.87°E，海拔878 m)采摘。去除葡萄果肉、果皮等，將葡萄籽在55℃下干燥48 h，磨成葡萄籽粉末，過40目標準篩，選取粒徑范圍為350～550 μm的顆粒進行后續(xù)的研究，真空密封后置于-20 ℃避光保存。

1.2 儀器與試劑

S-4800場發(fā)射掃描電鏡，Discovery V12熒光顯微鏡，TCS SP5激光共聚焦顯微鏡，HELIX超臨界天然產物萃取裝置，CM 1950冷凍切片機。

5 μg/mL尼羅紅的PBS染液(pH 7.4)；CO2氣體(純度≥99.9%)；亞油酸標準品(純度≥95%)；正己烷、乙醚、乙醇等其他試劑均為分析純。

1.3 掃描電鏡觀察葡萄籽粉末的微觀結構

稱取30 g葡萄籽粉末，以正己烷為溶劑，在75 ℃下索式提取300 min后，取出葡萄籽粉樣品，55 ℃真空干燥后，用Tissue-Tek OCT包埋劑對樣品進行包埋，冷凍至-20 ℃，切片，厚度設為100 μm，固定至導電膠，表面鍍金，采用掃描電鏡對有機溶劑提取前后的葡萄籽粉微觀結構進行觀測。

1.4 葡萄籽油的特異性染色及熒光定量

模擬物料的制備：稱取50 g葡萄籽粉末，乙醚回流2 h脫脂，再經水和乙醇混合液(1∶1)浸提2～3次，脫除糖、蛋白等極性成分，真空干燥，得到不含內容物的葡萄籽粉凈顆粒(net particle)。取4份0.5 g的凈顆粒，1份作為對照，其余3份分別與1 mL的5 mg/mL植物蛋白、亞油酸、葡萄籽油進行混合，真空浸漬，制備得含3類物質的模擬物料。

熒光觀測：包埋切片條件同1.2，將4個模擬物料都與10 μL的尼羅紅染液混合，暗室低溫靜置10 min。使用熒光顯微鏡在激發(fā)波長488 nm，吸收波長為528～600 nm下進行掃描觀測。

熒光定量：進行了多批次正己烷提取實驗，實驗條件同1.2，第一批次提取時間為30 min，每批次間隔30 min，最后一批次為270 min。每批次得到的提取液經旋轉蒸發(fā)脫除溶劑，得到葡萄籽油，稱質量，計算含油量(SOW)，重復3次取平均值；每批次提取后殘留的物料粉末，經包埋、冷凍切片、染色后，用熒光顯微鏡進行觀測。使用Image J (National Institutes of Health)圖像數據分析軟件標記200 μm×150 μm視野范圍內的熒光，計算熒光面積占比(Fluorescence area fraction, FAF)。由于冷凍切片厚度一致，葡萄籽粉末油含量與FAF值呈線性相關，可由公式來計算熒光法得到的含油量(SOF)：

SOF=0.14FAF+0.1

為驗證新構建熒光定量法的準確性，將該法與傳統(tǒng)稱重法進行相關性分析，計算相關系數R值。

1.5 CXE提取及熒光觀測葡萄籽油提取過程

稱取30 g葡萄籽粉末與等體積玻璃珠混勻后，裝入超臨界天然產物萃取裝置，將超臨界CO2(7.4 MPa、314 K)和乙醇混合形成CXE流體(摩爾比0.3)，對物料進行提取，定時取樣，旋轉蒸發(fā)除去乙醇，得到葡萄籽油，稱重，計算葡萄籽油的提取得率和速率并繪制曲線。

分別對各階段的葡萄籽粉進行了取樣，以提取前葡萄籽粉原料為對照樣品，經包埋、冷凍切片、染色后對不同階段的樣品進行熒光觀測。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察葡萄籽油提取的動態(tài)過程

取CXE不同提取階段殘留的葡萄籽粉物料，分別將粉末顆粒的中心區(qū)域A、淺表區(qū)域B、外表區(qū)域C進行包埋切片，厚度為50 μm。染色后，利用激光共聚焦顯微鏡在20倍物鏡下對樣品進行觀測，采用激發(fā)波長488 nm，接收波長550～600 nm，利用Z-stack掃描逐層收集Z軸方向上的熒光圖像，在連續(xù)掃描模式下獲得2D圖像，在最大強度模式下利用LAS-AF軟件生成三維復合熒光圖像。

超臨界CO2提取采用與CXE相同裝置，設定壓力為25 MPa，溫度為313 K，提取時間長為180 min。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡對葡萄籽粉末內部微觀結構的觀測

圖1為正己烷提取葡萄籽油前后粉末顆粒內部微觀結構的SEM圖像。提取前的葡萄籽顆粒的內部呈現均勻規(guī)則、緊湊的蜂巢狀多微腔結構，微腔為擬球形，平均直徑約為25 μm，多數微腔中存在大量的內容物；而葡萄籽物料經有機溶劑完全提取后，其內部微觀結構發(fā)生了顯著的變化，微腔結構呈現松散、不規(guī)則性，微腔直徑變大，表明溶劑提取造成了物料骨架結構的嚴重破損或坍塌，內容物已被提取殆盡?；赟EM的觀測雖然可以了解葡萄籽物料內部的微觀結構及存在的內容物，但并不能辨識內容物的化學組成。

圖1 葡萄籽粉末顆粒內部微觀結構SEM顯影 (標尺為40 μm)

2.2 葡萄籽油的特異性染色及熒光定量方法的構建

圖2 葡萄籽粉顆粒的尼羅紅特異性染色(標尺為50 μm)

為了進一步探究葡萄籽粉微觀結構微腔中內容物的組成，首先需要構建一種葡萄籽油特異性染色方法。如圖2所示，葡萄籽粉先經乙醚脫脂、水-乙醇溶液脫蛋白得到無內容物的葡萄籽粉凈顆粒(圖2a)，凈顆粒分別與植物蛋白、葡萄籽油主要成分亞油酸及葡萄籽油混合浸漬制成3種模擬物料(圖2b～圖2d)，采用尼羅紅染料進行染色，通過熒光顯微鏡進行觀測。凈顆粒及含親水蛋白質的模擬物料，染色后未發(fā)出熒光，而含亞油酸及葡萄籽油的模擬物料則呈現強烈的金黃色熒光。尼羅紅是一種苯并吩惡嗪類的疏水性染料[16]，能與脂類等極性物質特異性結合而發(fā)出金黃色熒光[17]，但在親水環(huán)境中幾乎是完全熒光淬滅(quench)的，這一特性可以用來監(jiān)測提取過程中物料內部油脂的存在情況。

基于尼羅紅對葡萄籽油的特異性染色的特性，進一步探討了熒光定量油脂的可行性。圖3分別用熒光定量和溶劑萃取法測定了正己烷提取葡萄籽油過程中，不同時間點物料中的油脂含量，并對2種方法結果進行了線性相關性分析。結果表明，2組數據的相關系數高達0.982，呈現嚴格的正相關，表明新構建的熒光定量方法的準確性與傳統(tǒng)的萃取稱重法相當，均能準確測定提取過程中物料顆粒中葡萄籽油的含量，為直觀地觀察葡萄籽油提取的動態(tài)過程提供新的思路。

2.3 二維熒光顯影葡萄籽油的CXE提取過程分析

Eckert等[5]優(yōu)化了CXE提取葡萄籽油的工藝條件，在壓力7.4 MPa、溫度314 K、CO2摩爾分率0.3的最優(yōu)條件下進行了提取實驗，提取呈現典型的溶劑提取三階段過程[18]：恒速期(0～35 min)、減速期(35～80 min)、擴散期(80～120 min)。對提取前葡萄籽粉原料及3個階段中的典型物料進行取樣，分別在明場(bright-field)和熒光場(fluorescence-field)視野下進行觀測。由圖4可知，明場條件下，可以觀察到各階段葡萄籽粉物料內部的多微腔結構，雖經加壓液體提取，但其微腔結構基本保持完整。熒光場條件下提取前葡萄籽粉原料呈現高亮的金黃色，熒光幾乎占滿視野，表明葡萄籽原料富含充足的油脂。經三階段的提取，熒光亮度顯著減弱，熒光占比由初始的96.4%逐漸降至5.1%，與之相對應的油得率在恒速期均勻上升至9.53%，在減速期則緩慢升至13.6%，并在擴散期保持恒定。實驗結果充分說明了二維熒光顯影能直觀地觀測提取過程中葡萄籽油含量的變化，但由于無法了解油脂在物料內部的空間分布及狀態(tài)，尚不能解釋在不同提取階段葡萄籽油的釋放速率的差異。

圖4 葡萄籽油提取各階段的熒光觀測 (標尺為100 μm)

2.4 三維激光共聚焦顯影對葡萄籽油提取過程的動態(tài)分析

葡萄籽粉顆?？梢暈橐粋€擬球體，半徑約為225 μm，如圖5a所示，分別對顆粒中心A區(qū)域、淺表層B區(qū)域及外表層C區(qū)域進行切片、染色，采用激光共聚焦技術進行顯影，考察了CXE提取不同階段中的油的空間分布及量的變化，結果如圖5b所示。提取前，原料粉末顆粒的微腔中富含葡萄籽油，FAF值接近100%；在提取的恒速階段，相比于顆粒中心A區(qū)域，B和C區(qū)域的FAF值顯著減小，表明吸附在外表層及存在于淺表層的油極易被提取，并以恒定速率釋放至CXE流體中，中心區(qū)域含油的微腔開始因加壓溶劑的滲透作用而膨脹。進入減速階段，中心區(qū)域的FAF值變化不大，微腔結構體積進一步變大，外表層和淺表層的FAF值已降至很低的水平，分別為13.1%和8.9%，提取速率顯著下降。在擴散階段，葡萄籽油從中心區(qū)域擴散至外表層，進而釋放至溶劑相，中心區(qū)域的含油量很低，FAF值僅為7.9%，而外表層和淺表層的油也基本被提取殆盡，但由于傳質推動力較小，葡萄籽油的得率基本保持不變。三維激光共聚焦顯影技術可以用于觀測在加壓液體提取過程中油的空間分布，并對油的釋放過程進行動態(tài)分析，進而闡明CXE不同提取階段的作用機制。

圖5 CLSM對CXE提取葡萄籽油的過程分析

2.5 三維激光共聚焦顯影對不同方法提取葡萄籽油過程的比較分析

傳統(tǒng)分析方法多從宏觀角度上通過整體物料的提取得率來評測提取方法，三維激光共聚焦技術可以觀測到微細物料顆粒內部目標成分的空間分布，觀測了正己烷、超臨界CO2和CXE這3種溶劑完全提取葡萄籽油后粉末顆粒內不同部位的油分布，結果如圖6所示。從粉末的中心區(qū)域來看，超臨界CO2提取后物料中尚含有大量葡萄籽油，FAF值約為27%，顯著高于正己烷和CXE提取；顆粒外表區(qū)域經提取后，正己烷和CXE提取殘留物料中油含量極低，FAF值分別為7.9%和5.3%，顯著低于超臨界CO2提取。結果表明，CXE流體較有機溶劑而言，具有更強的滲透能力，提取得率略高于正己烷提取，而同為加壓流體的超臨界CO2，其提取得率則低于其他2種方法。總而言之，三維激光共聚焦技術能夠直觀地顯示不同方法下油被溶劑提取的程度及過程，進而分析溶劑的極性、滲透能力等相關影響因素，可更為客觀地比較不同方法的提取能力。

圖6 不同方法提取葡萄籽油的CLSM顯影比較(標尺為100 μm)

3 結論

CXE和超臨界二氧化碳等加壓流體屬于環(huán)境友好型的綠色溶劑，但提取機制相對比較復雜，本研究嘗試構建了一套可視化微觀顯影技術，考察了在CXE提取過程中物料顆粒中油的空間分布，對其釋放過程進行動態(tài)分析，初步闡明了CXE提取葡萄籽油的機理，并從微觀角度直觀地比較了不同方法的提取能力?，F代食品工業(yè)已進入依托大數據和人工智能的快速發(fā)展階段，引入一些前沿的顯微成像技術，可有效地監(jiān)測加工處理過程中物料特性及主要成分的變化，追蹤目標成分在空間上的分布及遷移，最終有望形成一套實時準確的原位監(jiān)測方法，可促進實際的生產操作。