基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的松花粉調(diào)節(jié)高脂血癥機制探討△

余澤宇，梁士兵，高凱，石麗花，張紅，劉建平*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 國際循證中醫(yī)藥研究院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；4.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 煙臺 264006；5.新時代健康產(chǎn)業(yè)（集團）有限公司，北京 102206

高脂血癥（hyperlipidemia）是一種脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，指人體內(nèi)脂肪代謝或者運轉(zhuǎn)異常，使血液中血脂含量超出正常水平，血中膽固醇、三酰甘油過高或高密度脂蛋白過低。高脂血癥是導(dǎo)致心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的重要誘因，而CVD 是成年人死亡的主要原因之一。有研究表明，血脂異?？蓪?dǎo)致機體發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)，而炎癥因子的釋放可通過損害血管內(nèi)皮細胞及血管壁，增加動脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險[1]；也有研究指出，與總膽固醇水平正常的人相比，高脂血癥患者發(fā)生CVD的風(fēng)險大約是其2倍[2]。目前，臨床上使用的調(diào)脂藥物主要有他汀類、貝特類等，雖然療效顯著，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可能引發(fā)肝損傷、橫紋肌溶解、新發(fā)腫瘤和糖尿病等不良反應(yīng)[3]。因此，尋找治療高脂血癥的其他有效藥物十分必要。

松花粉，又名松花、松黃，為淡黃色粉末，主要來源于松科植物馬尾松Pinus massonianaLamb.、油松P.tabulieformisCarr.或同屬數(shù)種植物的干燥花粉[4]。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，在后期的《新修本草》《本草綱目》《本草從新》等中醫(yī)傳統(tǒng)著作中均有記載[5]。有研究顯示，松花粉對高脂血癥具有一定防治效果[6-8]。然而，松花粉作為一種中藥，存在成分復(fù)雜、多作用靶點、多作用通路的特點，采用傳統(tǒng)藥理研究方法難以系統(tǒng)、完整地闡明其作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點與中醫(yī)藥學(xué)的基本特點相吻合，可用來分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點的相互作用關(guān)系，是一門從系統(tǒng)層面揭示中藥對機體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用的新興學(xué)科，為研究傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代藥理學(xué)作用機制提供了新的思路[9-10]。

本研究通過對文獻及多種公共數(shù)據(jù)平臺進行檢索，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，初步揭示松花粉治療高脂血癥的潛在作用機制，為松花粉的進一步研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 松花粉靶點確定及篩選

以“松花粉”“化學(xué)成分”“靶點”為檢索詞，檢索并篩選中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com）[11]、中國知網(wǎng)（https://www.cnki.net）、PubMed 數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）中松花粉化學(xué)成分相關(guān)的數(shù)據(jù)和文獻，對其化學(xué)成分進行整理歸納，檢索日期截至2021 年6 月29 日。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[12]獲得化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)名稱和分子式，并導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch）[13]，設(shè)定物種為“人類”，以分子相關(guān)靶點可能性（probability）≥0.08為界值進行靶點預(yù)測和篩選。

1.2 疾病相關(guān)靶點篩選

以“hypertriglyceridemia”“hypercholesterolemia”“hyperlipidemia”為檢索詞，檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）[14]和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org）中與高脂血癥相關(guān)的潛在靶點，檢索日期截至2021年6月30日。其中，對GeneCards數(shù)據(jù)庫中的檢索結(jié)果進行合并后，按照相關(guān)性得分（relevance score）由高到低排序并刪除重復(fù)值，之后再以相關(guān)性得分≥1 為篩選原則對靶點進行篩選。將篩選得到的靶點與OMIM 數(shù)據(jù)庫所得靶點進行合并，從而得到所有高脂血癥相關(guān)靶點。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用Venny 2.1軟件將得到的松花粉相關(guān)靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，并繪制韋恩圖。進而提交至STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）[15]構(gòu)建智人的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，其中最小相互作用閾值設(shè)定為“highest confidence”，其余設(shè)置均為默認。得到PPI 網(wǎng)絡(luò)后，通過Cytoscape 3.8.2 軟件繪制松花粉成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)，并使用軟件中的Centiscape 插件計算各節(jié)點的中介中心性（betweenness）和度（degree）值；通過MCODE 插件進一步分析PPI 網(wǎng)絡(luò)，提取子網(wǎng)絡(luò)，得到潛在功能模塊。

1.4 富集分析

將松花粉-高脂血癥交集靶點導(dǎo)入Metascape 平臺（https://metascape.org/）[16]，設(shè)置P<0.01、最小通路相關(guān)基因數(shù)為3、富集因子>1.5，進行交集靶點的基因本體（GO）富集分析[17]以探索靶點可能涉及的分子功能、生物過程以及基因產(chǎn)物活躍位置；并進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析[18]，以探尋靶點參與的潛在通路。

2 結(jié)果

2.1 松花粉靶點確定及篩選

通過中國知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫共檢索得到松花粉化學(xué)成分相關(guān)文獻29篇，其中5篇[19-23]提及松花粉化學(xué)成分、分子式及結(jié)構(gòu)式，初步獲得松花粉化學(xué)成分31 個；通過TCMSP 提取松花粉化學(xué)成分8 個。對檢索到的化學(xué)成分進行合并，最終獲取化學(xué)成分35 個，見表1。通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測及篩選，獲取靶點953 個，對重復(fù)值進行刪除，最終共計獲取松花粉靶點300個。

2.2 高脂血癥相關(guān)靶點的獲取

通過檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫共得到高脂血癥相關(guān)靶點4815個，刪除重復(fù)值后剩余3061個，以相關(guān)性得分≥1為原則進行篩選，共得到相關(guān)靶點897個；通過檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫，共得到相關(guān)靶點860 個。將兩者進行整合并刪除重復(fù)值，最終得到高脂血癥相關(guān)靶點1550個。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

松花粉成分相關(guān)靶點和疾病相關(guān)靶點取交集后，得到共同靶點68 個，韋恩圖見圖1。將共同靶點提交至STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，見圖2。將化學(xué)成分和交集靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制藥物成分-交集靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)，見圖3。節(jié)點大小與成分-靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)節(jié)點連接數(shù)呈正相關(guān)。山柰酚、(2R,3R) -2-(3,5-dihydroxyphenyl) -3,5,7-trihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one、香橙素、β-谷甾醇和花旗松素成分節(jié)點的連接數(shù)≥20，可能是松花粉潛在關(guān)鍵成分。使用Centiscape 插件計算中介中心性和度值，計算后排序前10 的靶點蛋白見表2；使用MCODE插件對相互作用關(guān)系進行分析，得到潛在關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，見圖4。子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部連線密度較高，外部連線相對較少，因此被認為是潛在具有生物學(xué)意義的集合，可能為蛋白質(zhì)復(fù)合體或功能模塊，具有更密切的相互作用[24]。

表2 松花粉治療高脂血癥關(guān)鍵靶點

圖2 松花粉治療高脂血癥靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 松花粉成分與高脂血癥交集靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)

圖4 松花粉治療高脂血癥靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中子網(wǎng)絡(luò)

2.4 富集分析

針對68個關(guān)聯(lián)交集靶點，利用Metascape平臺進行GO 富集分析和KEGG 富集分析。GO 富集分析顯示，分子功能可能與核受體活性（GO:0004879）、脂質(zhì)結(jié)合（GO:0008289）、氧化酶活性（GO:0016491）、激素結(jié)合（GO:0042562）、類固醇激素受體活性（GO:0003707）、磷酸鹽結(jié)合（GO:0019902）、受體調(diào)節(jié)（GO:0030545）等相關(guān)（圖5A）；生物過程可能與類固醇代謝（GO:0008202）、炎癥反應(yīng)（GO:0006954）、活性氧化物代謝（GO:0072593）、細胞脂質(zhì)應(yīng)答（GO:0071396）、激素調(diào)節(jié)（GO:0010817）、代謝物前體和能量生成（GO:0006091）等相關(guān)（圖5B）；細胞組成可能與受體復(fù)合物（GO:0043235）、囊腔（GO:0031983）、核膜膜間隙（GO:0005641）、細胞膜（GO:0098552）、細胞外基質(zhì)（GO:0031012）、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物（GO:0090575）等相關(guān)（圖5C）。

圖5 松花粉治療高脂血癥靶點的GO富集分析

KEGG 富集分析顯示，松花粉治療高脂血癥的作用機制可能涉及缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 信號通路（hsa04066）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信號通路（hsa03320）、卵巢類固醇生成（ko04913）、脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)（hsa04923）、膽汁分泌（ko04976）、胰高血糖素信號通路（ko04922）、類固醇生物合成（hsa00100）、脂肪消化和吸收（ko04975）等，見表3。

表3 松花粉治療高脂血癥靶點KEGG富集分析潛在的相關(guān)通路

將子網(wǎng)絡(luò)進行KEGG富集分析，顯示子網(wǎng)絡(luò)1和2 與胰島素抵抗（hsa04931）、HIF-1 信號通路（hsa04066）、類固醇合成（hsa00100）可能有關(guān)，子網(wǎng)絡(luò)3未見到相關(guān)基因≥2的潛在通路，見表4。

表4 松花粉治療高脂血癥靶點子網(wǎng)絡(luò)KEGG富集分析潛在的相關(guān)通路

3 討論與總結(jié)

松花粉是中藥中少有的花粉類中藥材。近年來，關(guān)于松花粉及破壁松花粉等加工產(chǎn)物的藥用和保健價值的研究較多，其含有豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，具有抗衰老、緩解疲勞、降血糖、美容等多種保健和藥用功效[25]。松花粉因其“止血除風(fēng)”之性，多用以外敷，而內(nèi)服用藥時其調(diào)脂作用尤為受到關(guān)注[26]。含有松花粉的扶正化瘀方有助于抑制體外細胞和小鼠脂肪性肝纖維化進展[27-29]。馬尾松花粉水提物能夠促進高脂飲食小鼠脂質(zhì)代謝過程，使小鼠體質(zhì)量相對減輕、血脂水平有所改善[30]。樊柏林等[31]發(fā)現(xiàn)破壁松花粉能夠有效預(yù)防大鼠脂肪堆積。多項實驗及臨床研究均提示松花粉具有較好的調(diào)脂作用[7-8,32]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對生物網(wǎng)絡(luò)進行整合分析，可以提示藥物與作用靶點間的相互關(guān)系，為已知中藥的臨床療效和靶點開發(fā)提供理論依據(jù)[9]。本研究通過對現(xiàn)有文獻的總結(jié)，整理了松花粉的潛在成分，作為TCMSP 中化合物的補充。其中柚皮素被證實可抑制脂肪生成并降低脂肪細胞中胰島素敏感性[33]；龍腦可以顯著降低高糖高脂大鼠低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇和動脈粥樣硬化指數(shù)[34]。

成分-靶點網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了松花粉內(nèi)成分存在復(fù)雜的高脂血癥治療交互作用。其潛在關(guān)鍵成分中，山柰酚是一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理作用[35]。山柰酚可以通過刺激巨噬細胞中2 種高密度脂蛋白受體的蛋白表達，增加巨噬細胞膽固醇外排[36]。山柰酚還可以促進巨噬細胞、肝細胞和腸細胞中肝X受體（LXRs）及其靶基因的mRNA水平，誘導(dǎo)肝細胞PPAR 活性，抑制蛋白激酶B（Akt）并誘導(dǎo)肝細胞自噬，從而降低血漿和肝臟三酰甘油水平[37]。香橙素也是一種黃酮類化合物，具有很好的抗炎、抗氧化、抗增殖活性，可以改善葡萄糖攝取和胰島素抵抗，并抑制心臟纖維化及相關(guān)的纖維生成基因，對心功能有改善作用，這些都與高脂血癥的治療和預(yù)后相關(guān)[38]。花旗松素同樣具有抗炎、保護心血管等作用，可以降低大鼠血清和肝臟的脂濃度、肝臟總膽固醇水平[39]，抑制人低密度脂蛋白氧化[40]。β-谷甾醇對高膽固醇類高脂血癥作用效果良好，可以防止或逆轉(zhuǎn)肝臟和主動脈中脂質(zhì)和膽固醇濃度的增加[41-42]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，在“highest confidence”為最小相互作用閾值下，共存在68 個節(jié)點和113 條連接，其中中介中心性排序前10 的關(guān)鍵節(jié)點中與調(diào)脂可能相關(guān)的有類視黃醇X 受體α（RXRA）、β-淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）、Akt1、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基α（PIK3R1）、甲狀腺素運載蛋白（TTR）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）等。RXRA與脂質(zhì)代謝和脂肪細胞分化的調(diào)節(jié)相關(guān)[43]，參與膽汁酸和膽汁鹽的運輸、膽固醇代謝等血脂調(diào)節(jié)途徑；APP 可能參與胰島素受體結(jié)合和膽固醇代謝；Akt1是許多通路的關(guān)節(jié)靶點，功能涉及細胞生存、新陳代謝等[44]，和PIK3R1 一同參與胰島素對血糖、血脂的調(diào)節(jié)[45-47]；TTR則通過參與甲狀腺素調(diào)節(jié)對脂質(zhì)代謝產(chǎn)生影響；PRARA 是脂質(zhì)傳感器和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)器，其激活可以減少肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積累[48]，已被證明可治療血脂異常[49]。另外，與凝血和炎癥相關(guān)的潛在關(guān)鍵靶點，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）和腫瘤壞死因子（TNF）等，對高脂血癥造成的心血管病變有調(diào)節(jié)作用，可能是松花粉治療高脂血癥的非降脂相關(guān)的作用靶點。

GO富集展示了松花粉干預(yù)高脂血癥的蛋白在細胞內(nèi)的存在位點和潛在分子、生物學(xué)過程。KEGG信號通路富集分析表示，松花粉調(diào)脂的作用機制可能涉及HIF-1 信號通路、PPAR 信號通路、卵巢類固醇生成、脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)、膽汁分泌、胰高血糖素信號通路、類固醇生物合成、脂肪消化和吸收等。其中HIF-1 是響應(yīng)缺氧和激活基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，有研究顯示，HIF-1信號通路參與氧化低密度脂蛋白的抑制和高脂血癥的調(diào)控[50]，并且可通過抑制長鏈?；o酶A 脫氫酶與中鏈?；o酶A 脫氫酶抑制脂肪酸的分解代謝[51]。PPAR 在棕色脂肪的形成和體溫控制中起著核心的作用，可通過調(diào)節(jié)合成代謝和氧化過程之間的平衡來調(diào)節(jié)脂肪組織的動態(tài)平衡，存在增加脂肪酸氧化、脂質(zhì)分解代謝的能力[52]。胰高血糖素則可以降低三酰甘油的吸收和分泌、增加膽汁中膽固醇排泄，該通路可以通過調(diào)節(jié)肝脂代謝，從而調(diào)治血脂異常[53]。

研究結(jié)果初步說明了松花粉治療高脂血癥可能的作用機制，體現(xiàn)了松花粉多靶點、多通路、聯(lián)合調(diào)控、調(diào)節(jié)平衡的特點。但因為在分析中混入較多與高脂血癥關(guān)聯(lián)性不明顯的功能機制和通路，且針對基因相關(guān)作用特點缺乏明確的實驗確認，需要進一步實驗研究以明確松花粉治療高脂血癥的作用機制、松花粉對比其他降脂藥物作用的異同，從而為高脂血癥的治療提供更多思路和選擇。