千金子制霜前后提取物對人胚腎細(xì)胞HEK293的體外毒性作用△

楊子燁，張桂梅，王佩華，王慧楠，姜明瑞，張婧秋，岳珠珠，王志成，王英姿

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

千金子系大戟科大戟屬植物續(xù)隨子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟種子，味辛，性溫，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有瀉下逐水、破血消癥之功[1]，可用于水腫、痰飲、二便不通、積滯腹脹、瘀血經(jīng)阻，外治疣贅、頑癬[2-3]。千金子作為瀉下逐水藥中的有毒中藥，常制霜減毒后使用，但毒性一直制約著千金子的臨床應(yīng)用。目前初步研究認(rèn)為，千金子炮制減毒的機(jī)制主要與制霜后二萜醇酯類化合物含量降低有關(guān)，有研究表明千金子制霜后千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、千金子素L8的含量明顯降低[4-6]。

近年來文獻(xiàn)報道大戟科中藥多具有腎毒性[7-10]，但未見對千金子腎毒性作用的研究。人胚腎細(xì)胞HEK293 是源于胚胎腎臟組織的永生化細(xì)胞，常用于中藥的體外腎毒性研究[11-12]，因此本研究以HEK293 細(xì)胞為研究對象，通過比較千金子制霜前后提取物對HEK293 細(xì)胞的毒性差異，為探討千金子制霜減毒的作用機(jī)制提供新思路，為千金子的臨床安全應(yīng)用提供參考。

1 材料

千金子飲片（安徽滬譙中藥飲片廠，批號：1203070692）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)的劉春生教授鑒定為大戟屬續(xù)隨子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟種子。千金子生品及霜品提取物均為實驗室自制。

DMEM 培養(yǎng)基（批號：10569044）、胎牛血清（批號：10091-418）、胰酶（批號：15050057）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號：15140122）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：C10010500BT）均購于美國Thermo公司；細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號：C35006）、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062S）、細(xì)胞周期檢測試劑盒（批號：C1052S）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（批號：A020-2）、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（批號：A006-2-1）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒（批號：C013-2-1）、肌酐（Cr）檢測試劑盒（批號：C011-2-1）均購于南京建成科技有限公司；實驗用水由密理博純水儀制備。

IX51 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；311 型CO2恒溫培養(yǎng)箱、1550 型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；HR1500-IIA2型生物安全柜（海爾集團(tuán)）；5424 型離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Milli-Q Biocel 型純水機(jī)（美國Millipore 公司）；AUW120 D220D型分析天平（日本島津公司）；BD-C6型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

HEK293 細(xì)胞來自美國模式菌種收集中心（ATCC）細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 千金子生品、霜品提取物及供試品溶液的制備

千金子霜品由本實驗室采用壓制法對千金子去油制霜而成，參考《中華人民共和國藥典》2020 年版千金子霜項下方法[1]，取適量千金子，去皮取凈仁，碾碎如泥，經(jīng)微熱，壓榨除去大部分油脂，含油量符合要求后，取殘渣研制成符合規(guī)定的松散粉末。制備的千金子霜含油量為19.2%。

分別稱取千金子生品、霜品250 g 置于量瓶中，加95%乙醇加熱回流提取3 次。將提取液放冷后濾過，合并濾液，減壓回收至無醇味，加適量水分散，以等體積石油醚為溶劑萃取3 次，回收溶劑得千金子生品、霜品石油醚提取物。

取相當(dāng)于生藥量0.32 g 的千金子生品、霜品提取物，加入二甲基亞砜（DMSO）50 mL，制成生藥質(zhì)量濃度為6.4 mg·mL–1的母液，以DMEM 培養(yǎng)基等比例稀釋，得質(zhì)量濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0、3 200.0、6 400.0 μg·mL–1的供試品溶液，各供試品溶液以0.22μm的濾膜濾過后，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度70%～80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時，用胰蛋白酶消化，按照1∶4 進(jìn)行傳代，取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.3 CCK-8法檢測HEK293細(xì)胞存活率

將處于對數(shù)生長期的HEK293 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔5000 個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞生長到匯合狀態(tài)，加入質(zhì)量濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0、3 200.0、6 400.0 μg·mL–1的各千金子供試品溶液，同時設(shè)置空白組（只加入等體積的DMEM 培養(yǎng)基）和對照組（只加入細(xì)胞和等體積的DMEM 培養(yǎng)基），每組設(shè)置5 個復(fù)孔，處理48 h 后每孔加入CCK-8 溶液10 μL。在37 ℃孵育1 h 后，利用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度（A），按照公式（1）計算細(xì)胞存活率。

2.4 細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)觀察

選擇對數(shù)生長的HEK293細(xì)胞，以1×105個/孔均勻接種于6 孔板，分為對照組，千金子生品低、中、高質(zhì)量濃度（100、200、400 μg·mL–1）組和千金子霜品低、中、高質(zhì)量濃度（100、200、400 μg·mL–1）組。細(xì)胞置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，各給藥組分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的千金子生品和霜品提取物溶液1 mL。對照組給予等體積無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，每組分別設(shè)3個復(fù)孔。于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，置于倒置相差顯微鏡下觀察HEK293 細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

2.5 碘化丙啶（PI）染色法檢測細(xì)胞周期

選擇對數(shù)生長的HEK293 細(xì)胞，細(xì)胞分組及處理同2.4 項下。培養(yǎng)48 h 后，各給藥組分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的千金子生品和霜品提取物溶液1 mL。對照組加入等體積無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，每組分別設(shè)置3 個復(fù)孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，并用PBS 重復(fù)洗滌，棄去上清液后，加入預(yù)冷的70%乙醇1 mL 固定，輕輕吹打混勻，在4 ℃放置過夜。染色前用PBS 洗去固定液，1000×g離心5 min。加入PI/RNase staining buffer 0.5 mL混勻，避光條件染色30 min 后，使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm紅色熒光下檢測。

2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

選擇對數(shù)生長的HEK293細(xì)胞，細(xì)胞分組及處理同2.4項下。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰酶消化處理貼壁細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 溶液重復(fù)洗滌，1000×g離心5 min，棄上清。加入Binding Buffer 300 μL 于樣品管中使細(xì)胞懸浮，再加入Annexin VFITC 5 μL 及PI 10 μL，避光條件孵育15 min，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.7 試劑盒檢測生化指標(biāo)

選擇對數(shù)生長的HEK293細(xì)胞，細(xì)胞分組及處理同2.4項下。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書檢測上清液中BUN、Cr、LDH 水平。每孔細(xì)胞用PBS 溶液重復(fù)洗滌后，加入RIPA 細(xì)胞裂解液裂解30 min，收集細(xì)胞，4 ℃、12 000 r·min–1離心10 min（離心半徑為8.4 cm），取上清液，按照試劑盒的說明書測定細(xì)胞裂解液中GSH水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS 9.4 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 千金子制霜前后對HEK293細(xì)胞存活率的影響

CCK-8 結(jié)果表明，作用于HEK293 細(xì)胞48 h 后，與對照組比較，千金子生品組質(zhì)量濃度為50.0～6 400.0 μg·mL–1時，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性降低（P<0.01）；與千金子生品相應(yīng)質(zhì)量濃度組比較，千金子霜品組質(zhì)量濃度為50.0～1 600.0 μg·mL–1時，細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01），且呈量-效關(guān)系，見表1。

表1 千金子生品和霜品對HEK293細(xì)胞存活率的影響（,n=5）

表1 千金子生品和霜品對HEK293細(xì)胞存活率的影響（,n=5）

注：與對照組比較，**P<0.01；與千金子生品相應(yīng)質(zhì)量濃度組比較，##P<0.01。

3.2 千金子制霜前后對HEK293 細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)的影響

結(jié)果顯示，對照組HEK293 細(xì)胞數(shù)目多且形態(tài)呈梭形，細(xì)胞間隙較小，生長情況良好。與對照組比較，千金子生品組細(xì)胞數(shù)目減少、形態(tài)皺縮、體積變小、細(xì)胞間隙變大、凋亡小體增加。隨著千金子生品劑量增加，死亡細(xì)胞數(shù)目增加。與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度組細(xì)胞數(shù)目增加、形態(tài)皺縮的情況得以改善、細(xì)胞間隙縮小、凋亡小體減少、死亡細(xì)胞數(shù)目減少，且呈劑量依賴性，見圖1。

3.3 千金子制霜前后對HEK293細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，千金子生品各質(zhì)量濃度組HEK293 細(xì)胞G0/G1、G2/M 期比例顯著降低（P<0.05，P<0.01），S期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01）。與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度組S 期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），G2/M 期細(xì)胞比例升高（P<0.05，P<0.01），提示千金子生品可導(dǎo)致HEK293 細(xì)胞周期阻滯，而制霜后可明顯降低S 期細(xì)胞比例，升高G2/M 期細(xì)胞比例，結(jié)果見表2。

表2 千金子生品和霜品對HEK293細(xì)胞周期的影響（,n=3）

表2 千金子生品和霜品對HEK293細(xì)胞周期的影響（,n=3）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與千金子生品相應(yīng)質(zhì)量濃度組比較，#P<0.05，##P<0.01；表3～4同。

3.4 千金子制霜前后對HEK293細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，千金子生品各質(zhì)量濃度組HEK293 細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率顯著升高（P<0.05，P<0.01），呈劑量依賴性；與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度組可顯著降低細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率（P<0.01），且呈劑量依賴性，結(jié)果見表3。

表3 千金子生品和霜品對HEK293細(xì)胞凋亡的影響（,n=3）

表3 千金子生品和霜品對HEK293細(xì)胞凋亡的影響（,n=3）

3.5 千金子制霜前后對HEK293 細(xì)胞腎功能指標(biāo)的影響

與對照組比較，千金子生品各質(zhì)量濃度組HEK293細(xì)胞中GSH 水平顯著降低（P<0.01），LDH 活性顯著升高（P<0.01），BUN、Cr 水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）。與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度能顯著提高HEK293 細(xì)胞中GSH 水平（P<0.01），降低LDH活性和BUN、Cr水平（P<0.05，P<0.01），且具有一定的劑量相關(guān)性，見表4。

表4 各組HEK293細(xì)胞上清液中LDH、BUN、Cr水平及細(xì)胞內(nèi)GSH水平（,n=3）

表4 各組HEK293細(xì)胞上清液中LDH、BUN、Cr水平及細(xì)胞內(nèi)GSH水平（,n=3）

4 討論

中藥體外腎損傷可降低腎細(xì)胞存活率，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變差，BUN、Cr 溢出而進(jìn)入血漿。BUN、Cr是機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，反映氮的分解和腎的排泄功能，常用于腎臟疾病和藥物性腎組織損傷的監(jiān)測和診斷[13-14]，其含量變化與腎細(xì)胞損傷程度直接相關(guān)。LDH 是廣泛分布于腎細(xì)胞內(nèi)中的生化酶，正常時不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受損或缺氧時外泄到培養(yǎng)液中，故LDH 細(xì)胞外活力增高程度與腎損傷程度密切相關(guān)[15-17]。氧化損傷是導(dǎo)致腎損傷發(fā)生的機(jī)制之一，GSH 是一種細(xì)胞質(zhì)中普遍存在的抗氧化物，在細(xì)胞內(nèi)能清除過氧化物代謝產(chǎn)物，保護(hù)細(xì)胞免受氧化性傷，當(dāng)GSH 水平下降，機(jī)體氧自由基的清除能力降低，可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[18]，造成組織細(xì)胞損傷。綜上，當(dāng)腎細(xì)胞受到損傷時，機(jī)體內(nèi)氧化指標(biāo)和腎功能指標(biāo)異常，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的動態(tài)過程，從功能角度分成G0/G1期、S期和G2/M期[19]。當(dāng)細(xì)胞受到一定的刺激后，細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)過程會出現(xiàn)障礙，不能使細(xì)胞平穩(wěn)正常進(jìn)入下一個時期，造成細(xì)胞周期阻滯直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化死亡，經(jīng)一系列基因活化及調(diào)控細(xì)胞有序的、自主的主動死亡過程，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞衰老和機(jī)體生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[20]。當(dāng)腎細(xì)胞受到損傷時，能夠引起其細(xì)胞周期明顯阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖與分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究從細(xì)胞增殖與凋亡、氧化損傷及腎細(xì)胞功能角度初步探討了千金子制霜前后提取物對HEK293 細(xì)胞的毒性損傷及作用機(jī)制，實驗結(jié)果表明，千金子生品對HEK293 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，呈一定的量-效關(guān)系，并使細(xì)胞形態(tài)變差；千金子霜品對HEK293 細(xì)胞增殖的抑制作用明顯降低，可提高其存活率，并改善細(xì)胞形態(tài)。結(jié)合文獻(xiàn)[21-25]及本實驗結(jié)果分析，千金子生品造成腎細(xì)胞損傷可能有以下幾種途徑：1）降低HEK293 細(xì)胞在G0/G1期、G2/M 期的比例，升高S 期的比例，明顯抑制S 期向G2/M 期的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制受阻，減慢細(xì)胞分裂速度，降低細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2）造成腎細(xì)胞氧化損傷，機(jī)體內(nèi)積聚過多氧自由基，引發(fā)過氧化脂質(zhì)反應(yīng)，從而降低LDH和GSH水平，導(dǎo)致腎細(xì)胞膜損傷及細(xì)胞代謝異常，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3）使腎細(xì)胞膜受損，BUN、Cr等通過細(xì)胞膜溢出細(xì)胞進(jìn)入血漿，腎功能異常，造成HEK293細(xì)胞過度凋亡。千金子制霜后可通過減輕細(xì)胞氧化損傷，改善腎細(xì)胞功能損傷，減少細(xì)胞凋亡從而降低腎毒性，這為進(jìn)一步闡明千金子制霜減毒的機(jī)制提供了參考。