男性不育患者Y染色體AZF微缺失和外周血染色體核型分析

張 巧 雒 瑤 祝建疆 蔡莉蓉 聞小慧 曾 雯 唐國棟 戚 紅

北京市海淀區(qū)婦幼保健院(100089)

30%男性不育是由于遺傳疾病，包括非整倍體、染色體結(jié)構(gòu)異常、DNA損傷和基因突變，以及各種新發(fā)現(xiàn)的基因[1-2]。位于Y染色體上的AZF基因，也被稱作無精子癥因子，被發(fā)現(xiàn)其片段缺失與男性無精子癥或嚴重少精子癥有緊密的聯(lián)系[3-4]。本研究采取多重PCR技術(shù)對392例原發(fā)男性不育患者外周血提取的基因組DNA進行AZF檢測并進行染色體核型分析，分析原發(fā)不育患者Y染色體AZF微缺失和染色體核型異常情況，以探討其與男性不育之間的關(guān)聯(lián)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年7月-2021年7月本院收治的392例原發(fā)男性不育患者，平均年齡32歲(21～55歲)，其中無精子癥患者80例，嚴重少精子癥312例。經(jīng)患者知情同意，抽取肝素鈉抗凝血和EDTA抗凝血各2ml，分別用于染色體核型分析和AZF基因檢測。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取采用基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)抽提DNA，用微量紫外可見分光光度計測定DNA的濃度及純度。

1.2.2 Y染色體微缺失檢測利用Y染色體微缺失基因檢測試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)對AZF區(qū)內(nèi)的15個序列標簽位點(STS)進行檢測，其中6個確定分區(qū)的STS，包括AZFa區(qū)：sY84、sY86；AZFb區(qū)：sY127、sY134；AZFc區(qū)：sY254、sY255。還有8個確證是否整段完全缺失的STS，包括AZFa區(qū)：sY82、sY1064、sY1065、sY88；AZFb區(qū)：sY105、sY121、sY1192、sY153。另外還包括一個異染色體標簽sY160。其中，SRY基因作為性別異常對照，人類鋅指蛋白基因ZFX/Y作為實驗內(nèi)控。PCR體系及擴增參照試劑盒說明，用凝膠成像系統(tǒng)(美國ALPHA INNOTECH公司)觀察拍照并分析結(jié)果。

1.2.3染色體核型分析肝素鈉抗凝外周血0.5ml接種于淋巴細胞專用培養(yǎng)基(上海樂辰生物科技有限公司)中，37°孵育72h，秋水仙素處理并常規(guī)制備G顯帶，顯微鏡油鏡下進行染色體核型分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0進行處理。組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AZF 微缺失發(fā)生情況

在392例原發(fā)性男性不育患者共發(fā)現(xiàn)27例Y染色體AZF基因微缺失， Fisher精確檢驗統(tǒng)計無精癥和少精癥患者有差異(P<0.05)。AZF不同區(qū)域微缺失率中c區(qū)最高，其次是b+c區(qū)，b區(qū) 為0。 見表1。

表1 無精癥與少精癥患者Y染色體AZF區(qū)域微缺失發(fā)生情況比較[例(%)]

2.2 染色體異常核型檢出情況

392例原發(fā)不育患者中共發(fā)現(xiàn)有17例(4.3%)染色體核型異常，其中無精癥7例(8.8%)，少精癥10例(3.2%)。見表2。

表2 原發(fā)男性不育患者染色體異常和多態(tài)檢出情況[例(%)]

分類 少精癥 無精癥 平衡易位 46,XY,t(3;5)(p13;q33)1(0.3)0(0) 46,XY,t(7;8)(p15;q24.1),15ps+1(0.3)0(0) 46,XY,t(1;12)(q21;q23)1(0.3)0(0)倒位 inv(9)1(0.3)1(1.3)染色體多態(tài)常染色體多態(tài)性 1/9/16qh+/ps+4(1.2)2(2.6) Yqh+/Yqh Yqh+1(0.3)1(1.3) Yqh 1(0.3)0(0)

3 討論

精子產(chǎn)生障礙是男性不育的重要因素之一，其中位于Y染色體長臂的無精子癥基因AZF被研究發(fā)現(xiàn)能夠控制精子的發(fā)生[5]。AZF的微缺失能夠引起精子發(fā)生障礙，被認為是不孕男性精子發(fā)生失敗的第二大常見遺傳原因[6-7]。 本研究對就診的392例無精癥及少精癥患者進行AZF基因微缺失檢測，AZF總?cè)笔蕿?.9%,其中無精癥患者缺失率為18.7%；少精癥患者缺失率為3.8%。雖低于Liu等[9]AZF的總?cè)笔始吧倬Y患者缺失率，但是無精癥患者缺失率高于Liu等[9]的報道。

AZF區(qū)域是Y染色體微缺失片段中的好發(fā)部位，是目前唯一一個預測生精條件的指標。經(jīng)典分類中，AZF被分為AZFa、AZFb及AZFc區(qū)[8-9]。根據(jù)目前研究報道，AZF基因區(qū)域的6個序列位點，其中包括有AZFa區(qū)的sY84、sY86位點；AZFb區(qū)的sY127、sY134位點；AZFc區(qū)的sY254、sY255，這些位點的缺失所致的男性不育，占所有AZF微缺失的95%[10-12]。本研究采用多重PCR技術(shù)，對不育男性患者不同區(qū)域AZF微缺失的發(fā)生率進行比較，結(jié)果顯示，AZFc區(qū)微缺失率為2.8%，占本次檢測的所有微缺失的40.7%，在所有AZF微缺失中發(fā)生率最高，提示AZFc區(qū)缺失對精液質(zhì)量的影響更有相關(guān)性，與文獻報道一致[13]。本次檢測中，歐洲男科協(xié)會和分子遺傳質(zhì)量協(xié)作網(wǎng)(tEAA/EMQN)推薦用于確證AZFb完整性[10]的sY1192位點的缺失比例也較高，其中10例sY1192位點缺失，占本次檢測的37.0%，1例sY1192和sY153缺失，未發(fā)現(xiàn)b區(qū)經(jīng)典位點的缺失。sY1192位點在AZFb區(qū)和AZFc區(qū)重疊區(qū)域[14]，并且研究報道，AZFc區(qū)發(fā)生部分缺失時，常伴有sY1192缺失[14-16]。因此，位點sY1192的缺失，可能提示樣本存在AZFc區(qū)的部分缺失，對于精子生成影響程度仍需進一步研究。

性染色體數(shù)目異常是引起男性不育的常見原因之一。性染色體數(shù)目異常一般多引起減數(shù)分裂或后合子發(fā)育的早期階段出現(xiàn)異常，從而影響所有子細胞活性，或影響部分子細胞而引起的嵌合[17]。本組患者中性染色體數(shù)目異常8例，其中47,XXY 5例；48,XXYY 1例；45,X[27]/46,XY,Yqh-[73]嵌合型1例；47,XXY[4]/46,XY, [96]嵌合型1例。47,XXY核型表現(xiàn)癥狀即為Klinefeiter綜合征，是性染色體數(shù)目異常中常見類型。研究發(fā)現(xiàn)，多余的X染色體影響睪丸發(fā)育，導致成年男性不育癥和性腺功能低下[18]。嵌合體則是在減數(shù)分裂過程中X染色體分離不規(guī)律所致，其中兩種細胞類型的比例大小則直接影響疾病的嚴重程度。

除了性染色體外，常染色體異常也是男性不育的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，常染色體上存在影響精子活性的基因，易位或者倒位則可能破壞調(diào)控精子發(fā)生基因的完整性，從而影響精子的生成[19]。 本文中常染色體異常共8例，其中包含有倒位，平衡易位及羅伯遜易位。

綜上所述，Y染色體AZF基因微缺失及染色體異常是影響精子質(zhì)量的重要因素，臨床上通過相對應的檢測，可以找到男性不育的原因，避免不必要的藥物及手術(shù)治療，對于男性不育患者診斷及治療的改善有著重要的意義。