基于聚類分析和主成分分析的烏雞白鳳丸RRLC指紋圖譜研究

龐 威，樊 杰，紀(jì)天一,魯玉嬌，閆勝楠，郭英俠

（吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司·吉林 通化·134000）

烏雞白鳳丸又稱“白鳳丸”俗稱“烏雞調(diào)經(jīng)丸”，由明·龔?fù)①t《壽世保元》卷七的烏雞丸加減而成,原方出自唐朝,經(jīng)宋、元、明數(shù)代沿用和多次修訂,現(xiàn)已收載于《中國藥典》2020版一部中,處方中包括烏雞(去毛爪臟)、鹿角膠、醋鱉甲、煅牡蠣、桑螵蛸、人參、黃芪、當(dāng)歸、白芍、醋香附、天冬、甘草、地黃、熟地黃、川芎、銀柴胡、丹參、山藥、芡實(shí)（炒）、鹿角霜二十味藥材。有補(bǔ)氣養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)止帶的功效。臨床上常用于治療氣血兩虛、身體瘦弱，腰膝酸軟，月經(jīng)不調(diào)，崩漏帶下[1]。

本實(shí)驗(yàn)采用高分辨快速分離液相法（RRLC）對不同廠家、批次、劑型的烏雞白鳳丸進(jìn)行測定，建立了烏雞白鳳丸RRLC特征圖譜，同時(shí)對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析和主成分分析，取得了比較理想的分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以用來評價(jià)烏雞白鳳丸的真實(shí)性，優(yōu)良性和穩(wěn)定性，能夠較為全面的反應(yīng)其所含化學(xué)成分的種類，能夠?qū)蹼u白鳳丸質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司；FA2004A電子天平，上海精天電子儀器廠；精宏DMG-9123烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑

甲醇（分析純），北京化工廠；甲醇、乙腈（色譜純），Amethyst Chemicals。

1.3 試驗(yàn)藥品

不同廠家、劑型烏雞白鳳丸產(chǎn)品。詳見表1。

表1 烏雞白鳳丸樣品

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液制備

取烏雞白鳳丸，剪碎，精密稱取5g，置于50mL具塞錐形瓶，加甲醇25mL，稱重，記錄，浸泡過夜。超聲處理50min(100HZ)，補(bǔ)足減失液，過濾，取濾液通過0.45μm濾膜，作為供試品。

2.2 色譜條件

色譜柱：Elipse C18(1.8μm,3.0×100mm Agilent)；柱溫35℃；檢測器：DAD；檢測波長203nm；流動相A為超純水,B為乙腈；洗脫梯度：0-5min,40%B;5-15min,40-65%B;15-17min,65%B;17-20min,65-70%B;20-25min,70-75%B;25-30min,75-85%;35-40min,85-95%B;40-45min,95-100%;45-50min,100%B;流速：0.6ml/min；進(jìn)樣量：5μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取

取同一批烏雞白鳳丸供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定并記錄色譜圖。結(jié)果表明,各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別在0.005%～0.1%和0.02%～1.5%,均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批烏雞白鳳丸樣品,分別制備6份供試品溶液,進(jìn)行測定。結(jié)果表明,各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別在0.008%～0.4%和0.3%～3.2%,均小于5.0%,表明該方法重復(fù)性良好

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批烏雞白鳳丸供試品溶液,分別于0、3、6、12、24h進(jìn)樣測定,考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別在0.07%～0.6%和0.5%～2.7%,均小于5.0%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 烏雞白鳳丸RRLC特征圖譜的建立

按照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，對25批烏雞白鳳丸樣品進(jìn)行測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2004年版)進(jìn)行分析，得到了25批烏雞白鳳丸的RRLC指紋圖譜疊加圖。通過對樣品的測定，確定25批烏雞白鳳丸特征圖譜中出峰時(shí)間基本一致，峰面積較大13個峰為共有特征色譜峰，可以較為全面地反映烏雞白鳳丸的內(nèi)在質(zhì)量，樣品特征色譜圖的色譜峰情況見圖1。

圖1 烏雞白鳳丸RRLC指紋圖譜疊加圖

3.2 聚類分析

以各烏雞白鳳丸樣品色譜圖的13個共有峰作為評價(jià)指標(biāo)，以歐式距離作為衡量各劑型差別大小，采用最短距離法對各個烏雞白鳳丸進(jìn)行聚類分析。25批烏雞白鳳丸樣品，聚類譜系圖見圖2。

從圖2可以看出，樣品的聚類結(jié)果理想，這25個樣品可聚為9類，即10-12(世一堂大蜜丸)處于一類，樣品19-21（天?？邓弁瑁┨幱谝活悾?、6（藥都大蜜丸）處于一類，1-3（老君爐大蜜丸）處于一類，13-15（刻康水蜜丸）處于一類，16、17（老君爐水蜜丸）處于一類，22-24（修正水蜜丸）處于一類，7-9（同仁堂大蜜丸）處于一類，25（同仁堂水蜜丸）單獨(dú)處于一類，可明顯地將樣品按照廠家進(jìn)行區(qū)分。

圖2 烏雞白鳳丸聚類分析圖

當(dāng)距離約為15時(shí)，大體上可根據(jù)劑型將大蜜丸和水蜜丸分開，即如圖11、12（世一堂大蜜丸），5、6（藥都大蜜丸），1-3（老君爐大蜜丸）處于一類；16、17（老君爐水蜜丸），25（同仁堂水蜜丸），13-15（刻康水蜜丸），22-24（修正水蜜丸）處于一類；19-21（天?？邓弁瑁┖?-9（同仁堂大蜜丸）例外，總體上來說實(shí)現(xiàn)了劑型的區(qū)分。

3.3 主成分分析

為了更仔細(xì)地觀察各樣品的差異，分別采集了各樣品的RRLC圖譜中主要吸收峰，即共有峰峰面積值為指標(biāo)，采用SPSS13.0軟件對其樣品進(jìn)行了主成份分析，將它們投影至低維空間來看它們之間的細(xì)微差別詳見圖3。

由圖3可見，以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到2個主成份，累計(jì)貢獻(xiàn)率為60.8%，得到基于前2個主成份得分圖（圖3）。主成份分析的貢獻(xiàn)，PC1為43.3%，PC2為17.5%，其他的貢獻(xiàn)率較小，累計(jì)貢獻(xiàn)率為60.8%。其分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致，結(jié)果顯示，根據(jù)劑型的不同，可將大蜜丸和水蜜丸分成兩大組，即把大蜜丸和水蜜丸兩類劑型分開，可以表達(dá)烏雞白鳳丸的劑型信息。同時(shí)不同廠家同樣劑型的烏雞白鳳丸之間也能夠分開。

圖3 烏雞白鳳丸主成份分析得分圖1

由圖4可以看出，累計(jì)貢獻(xiàn)率為62.4%，這25個樣品可分為5類，即天福康水蜜丸、同仁堂水蜜丸、修正水蜜丸、刻康水蜜丸、同仁堂水蜜丸分別處于一類?？梢员磉_(dá)同樣是水蜜丸劑型的烏雞白鳳丸不同廠家的信息。

圖4 烏雞白鳳丸水蜜丸主成分分析得分圖2

由圖5可以看出，累計(jì)貢獻(xiàn)量為79.3%，這12個樣品可分為4類，即世一堂大蜜丸、同仁堂大蜜丸、老君爐大蜜丸、藥都大蜜丸各自的三個樣品單獨(dú)處于一類。可以表達(dá)同樣是大蜜丸劑型烏雞白鳳丸不同廠家的信息。

圖5 烏雞白鳳丸大蜜丸主成分分析得分圖3

4 討論

RRLC技術(shù)應(yīng)用于烏雞白鳳丸的特征圖譜研究，檢測時(shí)間較快，比HPLC方法縮短了分析時(shí)間，同時(shí)也提高了分離度和靈敏度，減少了流動相的消耗。文中應(yīng)用的方法所做的聚類分析結(jié)果與實(shí)際相符，說明聚類分析不但適合樣品不同等級、規(guī)格的鑒定，也適合樣品不同廠家及劑型的判別。

文中將25批不同的烏雞白鳳丸13個共有峰的單位質(zhì)量峰面積作為變量，進(jìn)行主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。由此可見，在烏雞白鳳丸特征圖譜的研究中，聚類分析可以對不同廠家、劑型的樣品做初步分組，而主成分分析又能進(jìn)一步驗(yàn)證聚類分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，為烏雞白鳳丸的鑒別與質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考。