多育節(jié)莢孢霉感染的微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和診療現(xiàn)狀

王星星，孟 涵，李曙光，王 啟，王 輝

多育節(jié)莢孢霉（Lomentospora prolificans）隸屬于真菌界，子囊菌門(mén)真子囊菌綱小囊菌目小囊菌科節(jié)莢孢霉屬（Lomentospora），雖然按之前分類歸類于賽多孢屬，但其在形態(tài)學(xué)和臨床特征上與賽多孢屬其他菌種并不相同[1-3]。多育節(jié)莢孢霉作為一種土壤腐生菌隨處可見(jiàn)，常在溫帶和熱帶地區(qū)的土壤中被分離出[4]，也在污水、腐物等受污染的環(huán)境中存在。其所引起的感染呈世界范圍內(nèi)分布，主要存在于澳大利亞、美國(guó)西南部和西班牙等地區(qū)[5-7]。與其他國(guó)家相比，澳大利亞感染的發(fā)病率相對(duì)較高，可能是由于澳大利亞有利于真菌生長(zhǎng)的氣候和環(huán)境，也有專家認(rèn)為土壤pH值起了一定的作用[8]。研究顯示西班牙、美國(guó)和加拿大等國(guó)家的土壤pH值范圍與澳大利亞土壤相 似[9]，報(bào)告的病例主要來(lái)自這些地區(qū)。

多育節(jié)莢孢霉感染可累及人體的多個(gè)器官和系統(tǒng)，可引起致死性感染，常見(jiàn)于血液系統(tǒng)疾病和免疫功能低下人群。由于其感染所累及的器官和系統(tǒng)較多及患者免疫功能不全等因素，導(dǎo)致臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，臨床診療難度增大?，F(xiàn)局限性和播散性感染病例逐年上升。播散性感染主要見(jiàn)于免疫功能不全患者，感染部位常累及多個(gè)部位，包括肺、腦、皮下組織等；而與創(chuàng)傷或溺水事件相關(guān)的感染通常導(dǎo)致局限性感染，感染以骨、關(guān)節(jié)、肺部和軟組織等為主[10-11]。1984年，Malloch 等[12]首次報(bào)道了多育節(jié)莢孢霉所致的骨髓炎，西班牙學(xué)者的研究結(jié)果顯示，血流感染的死亡率高于局限性感染[13]?；仡櫸靼嘌滥翅t(yī)院1990—1999年由多育節(jié)莢孢霉導(dǎo)致的血行播散感染中6例患者有5例死亡，而多育節(jié)莢孢霉引起的局限性感染中12例患者有6例死亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)多育節(jié)莢孢霉對(duì)多數(shù)抗真菌藥物存在耐藥性，包括臨床常用的唑類、兩性霉素、氟胞嘧啶類等藥物[13]。西班牙學(xué)者對(duì)多育節(jié)莢孢霉感染中分離的15株多育節(jié)莢孢霉進(jìn)行了體外抗真菌藥敏試驗(yàn)，對(duì)氟胞嘧啶、兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、酮康唑和咪康唑等測(cè)試藥物均為耐藥，該研究中的多育節(jié)莢孢霉感染死亡率超過(guò)50%[11,13]。因此，及時(shí)診斷并搶先治療對(duì)于多育節(jié)莢孢霉感染患者的最大生存期限和預(yù)后極為重要?，F(xiàn)就多育節(jié)莢孢霉的微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、鑒定和診療現(xiàn)狀作一綜述。

1 分類

真菌主要依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類，分級(jí)依次是門(mén)、亞門(mén)、綱、目、科，每個(gè)科又分為若干屬，這些屬又分為不同的種。目前真菌界分為7個(gè)門(mén)，主要有子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)。多育節(jié)莢孢霉原是子囊菌門(mén)真子囊菌綱小囊菌目小囊菌科賽多孢屬中的一種，因其在黏液團(tuán)中能產(chǎn)生伸長(zhǎng)的環(huán)痕細(xì)胞和倒卵球形的分生孢子，故早期被稱作多育賽多孢霉（Scedosporium prolificans）。然而，分子研究證明多育節(jié)莢孢霉與賽多孢屬親緣關(guān)系相距甚遠(yuǎn)，故被重新分類于節(jié)莢孢霉屬[14]，更名為多育節(jié)莢孢霉。多育節(jié)莢孢霉是節(jié)莢孢霉屬中唯一可引起人類致病的菌種，其感染呈世界性分布，但各地分離的多育節(jié)莢孢霉在生態(tài)學(xué)、耐藥性和臨床特征等方面也存在差異[13,15]。

2 微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 真菌培養(yǎng)

微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法是通過(guò)真菌培養(yǎng)來(lái)鑒定多育節(jié)莢孢霉，多育節(jié)莢孢霉在普通培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但因多育節(jié)莢孢霉不能耐受放線菌酮（環(huán)己酰亞胺），培養(yǎng)基中如含有放線菌酮將會(huì)抑制多育節(jié)莢孢霉的生長(zhǎng)甚至不生長(zhǎng)[13]，因此，許多真菌學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者建議選用半選擇性培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基對(duì)多育節(jié)莢孢霉進(jìn)行培養(yǎng)，因?yàn)檫@類培養(yǎng)基可以抑制曲霉等的生長(zhǎng)[15]。這類培養(yǎng)基包括Scedosporium Selective agar (SceSel+)及 其Scedo-Select Ⅲ，培養(yǎng)基中包含苯異甲基和氯硝銨[16-17]，Blyth等[18]和Sedlacek等[19]大多數(shù)學(xué)者通過(guò)研究建議將非選擇性培養(yǎng)基如SDA和選擇性培養(yǎng)基聯(lián)合使用，選擇性培養(yǎng)基最好選SceSel+或DRBC，但微生物真菌培養(yǎng)工作選擇SDA和SCDA聯(lián)合使用，即可滿足培養(yǎng)需求。

2.2 形態(tài)學(xué)

多育節(jié)莢孢霉生長(zhǎng)速度較其他絲狀真菌稍慢，且缺乏氣生菌絲，所以如同時(shí)有快生長(zhǎng)的絲狀真菌（如曲霉等）常會(huì)掩蓋多育節(jié)莢孢霉的生長(zhǎng)，而導(dǎo)致漏檢。多育節(jié)莢孢霉在平板上菌落形態(tài)較為多變，因此常常給臨床初次分離鑒定帶來(lái)困難。培養(yǎng)2 d一般可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，在28℃溫度下培養(yǎng)5～7 d，SCDA培養(yǎng)基上菌落表面平坦、擴(kuò)展、黑色，絨毛樣。SDA培養(yǎng)基上菌落表面平坦、擴(kuò)展、橄欖灰綠色，絨面革樣。見(jiàn)圖1。多育節(jié)莢孢霉初步鑒定一般可用乳酸酚棉藍(lán)（或苯胺藍(lán)）染液染色后在熒光顯微鏡的400倍鏡下觀察，可見(jiàn)多育節(jié)莢孢霉以環(huán)痕產(chǎn)孢的方式產(chǎn)生分生孢子，分生孢子與菌絲相連的基部膨大，呈燒瓶形，分生孢子合軸成小堆，單細(xì)胞，透明到淡褐色，卵圓形到梨形，壁薄，光滑，見(jiàn)圖2。

3 菌種鑒定

3.1 表型鑒定

絲狀真菌的表型鑒定方法是利用碳水化合物和酶活性在40℃和45℃環(huán)境下生長(zhǎng)。這些表型有助于菌種的鑒別，國(guó)外一些實(shí)驗(yàn)室有使用。用于表型鑒定的商業(yè)試劑盒有Taxa Profile Micronaut（Marlin Diagnostika GmbH, Berlin, Germany） 和GENⅢMicroPlateTM（BiologInc,Hayward, CA,USA）[20-21]，用來(lái)檢查真菌的各種生化反應(yīng)系統(tǒng)。在實(shí)際工作中，表型方法已經(jīng)基本被基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）鑒定和分子方法取代。

3.2 MALDI-TOF MS

盡管多位點(diǎn)DNA測(cè)序被認(rèn)為是參考方法，MALDI-TOF MS能快速、相對(duì)經(jīng)濟(jì)地鑒定多育節(jié)莢孢霉感染，與許多分子方法相比具有相對(duì)的準(zhǔn)確性，但前提是MS數(shù)據(jù)庫(kù)包含參考譜圖[22]。 Vitek?MS v3.0 （bioMerieux, Marcy L’etoile, France）在2017年7月被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于絲狀真菌鑒定，但不包含多育節(jié)莢孢霉的譜圖。其MALDI-TOF MS系 統(tǒng) 還 有MALDI Biotyper（Bruker Daltonics, Bremen, Germany）、Andromas（Andromas SAS, Paris, France） 和Axima-SARAMIS（Shimadzu/AnagnosTec,Duisburg, Germany）僅依靠這些數(shù)據(jù)庫(kù)也不足以鑒定多育節(jié)莢孢霉[23-24]。雖然在Bruker數(shù)據(jù)庫(kù)中有多育節(jié)莢孢霉，但4種菌株中只有1種被鑒定出來(lái)，然而4種菌株都是使用增強(qiáng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定的，這表明檢測(cè)性能更依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)中是否包含本地菌株的譜型。

一般有兩種方法：①雙甲酸夾心法[25]，即在靶板上先加1 μL甲酸，然后用無(wú)菌槍頭取絲狀真菌菌絲與甲酸充分混勻，自然干燥后再加1 μL的甲酸，最后在干燥后添加1 μL基質(zhì)，然后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。②甲酸乙腈萃取法，按照Bruker和Vitek MS系統(tǒng)推薦的絲狀真菌提取絲狀真菌蛋白，在此基礎(chǔ)上可以使用磁珠震蕩破壁、預(yù)加熱等[26]對(duì)破壁環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。提取后取1 μL樣本點(diǎn)靶，自然干燥后添加1 μL基質(zhì)，干燥后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。鑒定評(píng)分：每株菌點(diǎn)靶2次進(jìn)行鑒定，記錄結(jié)果一致時(shí)的菌名和鑒定得分[27]，鑒定標(biāo)準(zhǔn)為鑒定到種水平得分≥1.7分或＜1.7分但所有鑒定結(jié)果一致為同一種菌；鑒定得分在1.5～＜1.7分可為屬水平，＜1.5分或者鑒定結(jié)果為多種菌，則鑒定結(jié)果不可靠。Sleiman等[28]通過(guò)將Bruker MS絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)與實(shí)驗(yàn)室自己建立的包含4種節(jié)莢孢霉參考譜圖數(shù)據(jù)聯(lián)合使用，可將鑒定合格率從18%提升至94%。

3.3 分子生物學(xué)

對(duì)患者感染部位的標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)是多育節(jié)莢孢霉感染的快速診斷方法，特別是在因真菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)而未報(bào)告結(jié)果之前?；贒NA序列的分析是目前所有真菌物種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。對(duì)真菌的DNA進(jìn)行識(shí)別，其特定區(qū)域能夠鑒別出多育節(jié)莢孢霉。滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增（RCA）是使用簡(jiǎn)單的恒溫?cái)U(kuò)增模式鑒定單核苷酸序列，有學(xué)者利用ITS-directed RCA鑒定出了多育節(jié)莢孢霉[29]。RCA的優(yōu)點(diǎn)是程序可以快速執(zhí)行（2 h內(nèi)）且僅需要恒溫水浴，具有操作簡(jiǎn)單和成本低的優(yōu)點(diǎn)。

3.4 二代測(cè)序技術(shù)（NGS）

應(yīng)用NGS進(jìn)行絲狀真菌的鑒定正在應(yīng)用于臨床，但目前用NGS來(lái)鑒定多育節(jié)莢孢霉較少。國(guó)外的一項(xiàng)小型研究顯示檢測(cè)了一家醫(yī)院8個(gè)月分離的4株多育節(jié)莢孢霉[30]，各分離株間存在 10 000個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）。不同生物信息數(shù)據(jù)分析結(jié)果將干擾最終結(jié)果，在研究遺傳多態(tài)性時(shí)將真菌的這種多態(tài)性考慮在內(nèi)也很重要。而且NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，檢測(cè)成本昂貴，對(duì)臨床標(biāo)本要求也高，因此并不適用于微生物日常真菌鑒定工作，但在患者難確診病因且經(jīng)濟(jì)允許狀況下可供選擇。

4 診療現(xiàn)狀

4.1 診斷

臨床診斷多育節(jié)莢孢霉感染一般除了實(shí)驗(yàn)室診斷外，更多的還是依靠患者的流行病學(xué)史、臨床特征、組織病理學(xué)、影像學(xué)和血清學(xué)進(jìn)行診斷。

4.1.1 組織病理學(xué) 雖然用組織病理學(xué)的方法無(wú)法將真菌鑒別到種，但通過(guò)傳統(tǒng)染色，如鍍銀（GMS）染色，蘇木精和伊紅（HE）和過(guò)碘酸-希夫（PAS）染色，對(duì)侵襲性真菌感染（IFD）的診斷都有很高的臨床價(jià)值[31]。許多學(xué)者強(qiáng)烈推薦如高度懷疑多育節(jié)莢孢霉感染的患者可取組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[15,31]。多育節(jié)莢孢霉能產(chǎn)生色素沉著于菌絲上，因此可直接鏡檢觀察，組織病理學(xué)特點(diǎn)與曲霉感染相似，菌絲外觀透明，也有分枝、分隔，且呈銳角。有學(xué)者認(rèn)為患者組織中的菌絲常有兩條平行菌絲分枝呈H型分布[31-32]，可作為組織病理學(xué)觀察依據(jù)，但并不具有特異性。

4.1.2 影像學(xué) 多育節(jié)莢孢霉引起的絲狀真菌侵襲性感染影像學(xué)主要表現(xiàn)為實(shí)變、結(jié)節(jié)、壞死性肺炎、肺膿腫和胸膜滲出[12,14]，無(wú)特異性可作為輔助診斷。

4.1.3 血清學(xué) 懷疑多育節(jié)莢孢霉感染的患者可進(jìn)行G試驗(yàn)，G試驗(yàn)檢測(cè)的主要成分是真菌細(xì)胞壁抗原（1，3）-β-D-葡聚糖。（1，3）-β-D-葡聚糖存在于真菌的細(xì)胞壁中，在除毛霉和隱球菌感染外的IFD患者血液中能夠檢測(cè)到。G試驗(yàn)檢測(cè)快速，血清、腦脊液、肺泡灌洗液等標(biāo)本都可用于臨床檢測(cè)，由于某些抗真菌藥物（如米卡芬凈、卡泊芬凈等）會(huì)干擾G試驗(yàn)的結(jié)果，一般推薦在抗真菌用藥前或用藥6 d內(nèi)進(jìn)行G試驗(yàn)檢測(cè)[33]。其陰性預(yù)測(cè)值可達(dá)96%～100%，但特異性不高，因此一般用G試驗(yàn)作為臨床高危人群篩查和輔助診斷[34]。

4.2 治療

國(guó)際上對(duì)于多育節(jié)莢孢霉感染在患病率和發(fā)病率數(shù)據(jù)上并沒(méi)有大數(shù)據(jù)支持，很大程度上來(lái)說(shuō)是未知的[35]，而我國(guó)多育節(jié)莢孢霉感染病例報(bào)告較少[36]。Seidel等[3]分析了2000—2018年的相關(guān)數(shù)據(jù)（PubMed和FungiScope?registry），來(lái)自澳大利亞、美國(guó)、日本和西班牙等國(guó)家的56例多育節(jié)莢孢霉感染病例[澳大利亞（14例），美國(guó)和日本（各8例），西班牙（7例），法國(guó)和德國(guó)（各5例），其他國(guó)家（印度、意大利和英國(guó)各2例，巴西、荷蘭和波蘭各1例]被納入分析。分離的56株多育節(jié)莢孢霉中18株有藥敏結(jié)果（見(jiàn)表1），在所有抗真菌藥物的藥敏試驗(yàn)中，MIC中位數(shù)為 8 mg/L或更高。偶有米卡芬凈、兩性霉素B或伏立康唑?qū)Ψ蛛x株的MIC為1 mg/L或更低。除米卡芬凈外，所有被檢測(cè)的抗真菌藥物的MIC均至少為 4 mg/L。

表1 18株多育節(jié)莢孢霉菌株的體外藥敏

多育節(jié)莢孢霉對(duì)目前可選用的抗真菌藥物均具有一定耐藥性，而且由于存在著物種特異性易感模式，因此必須鑒定到種，才能準(zhǔn)確地給予合理治療，使患者有一個(gè)良好的預(yù)后[37]。近幾年的研究顯示聯(lián)合抗真菌治療要比單藥治療的28 d生存率高（聯(lián)合治療24例，生存15例，生存率為63%；單藥治療16例，生存4例，生存率為25%）[38]。一般首選治療用藥是伏立康唑，近幾年研究顯示特比萘芬和伏立康唑聯(lián)合用藥后患者預(yù)后相對(duì)更好[13,39-40]。雖然特比萘芬一般不單獨(dú)用于臨床治療，但與伏立康唑聯(lián)合在體外具有協(xié)同作用，泊沙康唑也有一定程度上的協(xié)同作用。有文獻(xiàn)研究表明伏立康唑聯(lián)合兩性霉素B也有一定治療效果，但患者生存率相對(duì)較低[38]。而指南一般推薦伏立康唑?yàn)橐痪€藥物聯(lián)合其他抗真菌藥物進(jìn)行治療，通常將特比萘芬與伏立康唑聯(lián)合使用進(jìn)行治療[35]。雖然聯(lián)合治療可以改善臨床表現(xiàn)但并不能根除真菌[41]，因此一般在藥物治療的同時(shí)用手術(shù)作為輔助治療，手術(shù)切除病變部位是治療多育節(jié)莢孢霉感染的重要手段，手術(shù)后患者預(yù)后較好。對(duì)于免疫功能缺陷患者在藥物治療的同時(shí)提高患者免疫功能也是治療的重要輔助手段。

4.3 預(yù)后

對(duì)于感染多育節(jié)莢孢霉的患者，其預(yù)后和感染者的基礎(chǔ)疾病和感染部位相關(guān)，侵襲性感染的患者預(yù)后差，平均生存率低，局部感染患者經(jīng)外科手術(shù)和抗真菌治療后預(yù)后較好。國(guó)內(nèi)2019年報(bào)道顯示多育節(jié)莢孢霉感染僅3例[36]，1例局限性鼻竇感染患者外科干預(yù)后預(yù)后良好，2例侵襲性感染患者中1例死亡，另1例未知。國(guó)外2019年研究數(shù)據(jù)顯示多育節(jié)莢孢霉感染[3]中有惡性腫瘤的死亡率可達(dá)85.7%，惡性腫瘤中的侵襲性感染死亡率可高達(dá)91.7%；實(shí)體器官移植死亡率達(dá)85.7%；免疫功能正常的患者死亡率相對(duì)較低（25%）。

綜上所述，微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和病理學(xué)檢測(cè)都能輔助診斷多育節(jié)莢孢霉，其中PCR檢測(cè)和質(zhì)譜鑒定可用于確診。而NGS方法常需要專業(yè)的檢驗(yàn)人員和場(chǎng)所，而且由于NGS檢測(cè)費(fèi)用較高，一般不推薦用于臨床常規(guī)檢查，除非一些疑難且無(wú)法確定病因的患者，但同時(shí)也要考慮患者經(jīng)濟(jì)條件。因此，在資源有限的情況下，真菌培養(yǎng)和形態(tài)檢測(cè)仍然是診斷的主要手段，在菌種鑒定方面，可優(yōu)先考慮質(zhì)譜。因多育節(jié)莢孢霉感染存在早期診斷困難和診斷時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，我們應(yīng)提高對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，并促進(jìn)質(zhì)譜和分子生物學(xué)鑒定的開(kāi)展，從而提高早期診斷率，以便臨床及時(shí)合理治療改善患者預(yù)后，降低多育節(jié)莢孢霉感染的死亡率。