荷葉總生物堿的制備方法研究

★ 陳強(qiáng) 楊維丹 劉永靜（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州 350122）

荷葉是睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉，味苦，性平，歸肝、脾、胃經(jīng)，主要用于治療暑熱煩渴，暑濕泄瀉，脾虛腹瀉，便血崩漏，血熱吐衄等證［1］。荷葉作為一味藥食同源的中藥，既可在治療疾病中發(fā)揮藥效，又可在平時(shí)泡茶飲或烹飪中起保健作用，這些功效是基于荷葉中主要含有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分［2］。其中對(duì)荷葉中生物堿的研究始于19世紀(jì)，自日本學(xué)者福田真雄等［3］從荷葉中分離出荷葉堿、蓮堿及O-去甲基荷葉堿3個(gè)單體成分以來,隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，人們已從荷葉中發(fā)現(xiàn)27種荷葉生物堿單體化合物［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，荷葉中含有的生物堿在降血脂、抑菌、抗炎、降糖等方面具有明顯的藥理活性［5-8］，具有一定的應(yīng)用前景。但是荷葉中含有的生物堿類成分含量較低，提取純化方法操作繁瑣［9-10］，因此，研究高純度、操作簡(jiǎn)便的荷葉中生物堿的提取純化方法成為關(guān)鍵問題，本研究建立大孔吸附樹脂-分散固相萃取法結(jié)合的荷葉生物堿的純化方法，經(jīng)過兩步純化以提高荷葉總生物堿的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U-3000高效液相色譜儀，UV檢測(cè)器（美國(guó)DIONEX公司）；XS 105型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥

荷葉堿對(duì)照品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：W03J8Z27223）。荷葉藥材（產(chǎn)地湖南），購(gòu)自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司。

甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，西隴化工有限公司）；三乙胺（分析純，西隴化工有限公司）；冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；D-101大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩吸附材料有限公司）；氨水（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；高分子陽(yáng)離子交換填料（PCX，40～60 μm，天津博納艾杰爾公司）；水為超純水，由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 荷葉堿的含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（每1 000 mL水中含有25.5 mL三乙胺，11 mL冰醋酸，49∶51）；柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制精密稱取荷葉堿對(duì)照品4.92 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL至25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成荷葉堿對(duì)照品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系的考察取荷葉堿對(duì)照品溶液，分別精密進(jìn)樣1、2、5、10、20 μL，以對(duì)照品的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立荷葉堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷葉堿在0.019 7～0.393 6 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=31.352X-0.001 9（r=0.999 9）。

2.2 荷葉生物堿提取工藝優(yōu)選

采用乙醇加熱回流的提取方法對(duì)荷葉中生物堿類成分進(jìn)行提取，并對(duì)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，優(yōu)化荷葉總生物堿的提取條件。

2.2.1 乙醇濃度的考察分別以75%、80%、85%、90%的工業(yè)乙醇作為提取劑，在料液比（g/mL）為1∶50的條件下進(jìn)行回流提取，提取2次，每次1.5 h，以考察乙醇濃度對(duì)荷葉堿提取率的影響，結(jié)果見圖1（A）。由圖可知當(dāng)乙醇濃度為85%時(shí)，荷葉堿的提取率最高，因此，選擇85%的乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 料液比的考察在以85%乙醇為提取溶劑、提取2次、每次1.5 h的提取條件下，分別考察了料液比（g/mL）為 1∶10、1∶25、1∶50、1∶100對(duì)荷葉堿提取率的影響。結(jié)果見圖1（B）。由圖可知，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)荷葉堿的提取率最高，因此，確定料液比為1∶50。

2.2.3 提取時(shí)間的考察在以85%乙醇作為提取劑、料液比（g/mL）為1∶50、提取次數(shù)為2次的條件下，分別考察了提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5 h對(duì)荷葉堿提取率的影響，結(jié)果見圖1（C）。由圖可知表明提取時(shí)間對(duì)荷葉堿的提取率影響不大，最終確定最優(yōu)提取時(shí)間為1.5 h。

圖1 乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和提取次數(shù)（D）對(duì)荷葉堿提取率的影響

2.2.4 提取次數(shù)的考察以85%乙醇作為提取劑，在料液比（g/mL）為1∶50的條件下進(jìn)行回流提取，分別考察了提取次數(shù)為1、2、3、4次對(duì)荷葉堿提取率的影響，每次1.5 h，結(jié)果見圖（1D）。由圖可知，當(dāng)提取3次時(shí)，荷葉堿的提取率最高，但提取2次與提取3次的荷葉堿的提取率相差不大，因此，綜合考察到實(shí)驗(yàn)效率，最終確定提取次數(shù)為2次。

2.2.5 最佳工藝確認(rèn)綜上所述，可知荷葉生物堿乙醇回流提取的最佳條件為：85%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶50，每次提取1.5 h，共提取2次。在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行3次提取實(shí)驗(yàn)，得到荷葉堿的提取率分別是0.089 5%、0.087 4%、0.088 9%，平均提取率為0.088 6%，RSD為1.2%。

2.3 大孔吸附樹脂純化工藝的優(yōu)化

2.3.1 實(shí)驗(yàn)方法精密稱取預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂250 g，進(jìn)行濕法裝柱，用工業(yè)乙醇洗至流出液與水混合（V∶V=1∶5）不產(chǎn)生白色渾濁，再用蒸餾水洗至流出液無醇味即可，放置一夜。將“2.2”項(xiàng)優(yōu)化后得到的醇提液進(jìn)行濃縮，濃縮至每毫升醇提物相當(dāng)于原藥材0.15 g進(jìn)行上樣，上樣體積為1 BV，待吸附2 h后開始洗脫。然后進(jìn)行洗脫，首先用4 BV蒸餾水進(jìn)行洗脫，再分別用4 BV 30%、50%、60%、70%工業(yè)乙醇依次洗脫，合并收集1～3 BV 60%乙醇、1～3 BV 70%乙醇洗脫液，回收溶劑，蒸干，得固體粉末，即為荷葉大孔樹脂純化物。

2.3.2 泄露曲線的考察精密稱取預(yù)處理過的D101大孔吸附樹脂250 g濕法裝柱，分別以0.5 BV、1 BV、1.5 BV、2 BV上樣，接收柱后流出液，測(cè)定其中荷葉堿的濃度。結(jié)果見圖2。由圖可知當(dāng)上樣體積達(dá)到1.5 BV時(shí)，流出液中荷葉堿濃度突然變大，說明此時(shí)大孔吸附樹脂已經(jīng)達(dá)到了飽和，因此，確定最佳上樣體積為1 BV。

圖2 大孔吸附樹脂的泄漏曲線

2.3.3 洗脫液濃度的考察精密稱取預(yù)處理過的大孔吸附樹脂250 g濕法裝柱，1BV上樣，上樣2 h后開始洗脫，先以4 BV的水洗脫，再分別以30%、50%、60%、70%（4 BV）的乙醇洗，每0.5 BV單獨(dú)接收洗脫液，測(cè)定洗脫液中荷葉堿的濃度。結(jié)果表明，1～3 BV 50%、60%、70%的乙醇洗脫液中荷葉堿的含量均較高，因此分別單獨(dú)接收50%、60%、70%洗脫液1～3 BV，回收溶劑，干燥，測(cè)定不同乙醇濃度純化物中荷葉堿的含量。結(jié)果表明，60%和70%乙醇所得到的純化物中荷葉堿的含量高于50%乙醇所得的純化物。因此，確定接收1～3 BV 60%乙醇、1～3 BV 70%乙醇洗脫液。

2.3.4 大孔吸附樹脂純化工藝的確認(rèn)按“2.3.1”最優(yōu)大孔吸附樹脂純化工藝進(jìn)行3次確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，回收乙醇，干燥得大孔吸附樹脂純化物。取大孔吸附樹脂純化物約0.2 g，精密稱定，用甲醇適量溶解并稀釋至25 mL，再精密吸取0.5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，用液相色譜法分析，計(jì)算荷葉堿的含量，分別為7.40%、7.27%、6.84%。結(jié)果表明，三批次的大孔樹脂純化物中荷葉堿的含量為6.84%～7.40%。

2.4 PCX分散固相萃取工藝的優(yōu)化

2.4.1 實(shí)驗(yàn)方法取大孔吸附樹脂純化物約0.2 g,加甲醇溶解并稀釋至100 mL，分別加入到盛有PCX填料（每10 mL溶液對(duì)應(yīng)于300 mg PCX）的燒杯中，磁力攪拌5 min后，進(jìn)行抽濾，將PCX轉(zhuǎn)移至另一燒杯中，再加入4倍體積的甲醇，磁力攪拌5 min后，進(jìn)行抽濾；再將PCX轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入3倍體積的5%氨-甲醇溶液，磁力攪拌5 min后，進(jìn)行抽濾，收集5%氨-甲醇洗脫液,回收溶劑，干燥得固體粉末，即為荷葉生物堿純化物。

2.4.2 PCX用量的考察取大孔吸附樹脂純化物0.2 g,加甲醇溶解并稀釋至100 mL，量取上述溶液10 mL,分別置于裝有 50、100、150、200、250、300、350、400 mg PCX填料的燒杯中，按“2.4.1”進(jìn)行純化，分別測(cè)定每個(gè)母液中荷葉堿的濃度。結(jié)果見圖3（A）。由圖可知，當(dāng)PCX用量達(dá)到300 mg時(shí)，母液中的荷葉堿含量比較小，說明絕大部分的生物堿已被PCX所吸附，當(dāng)繼續(xù)增加填料用量時(shí)，母液中的荷葉堿濃度并未見明顯降低，說明填料用量達(dá)到飽和狀態(tài)，因此，PCX填料的用量選擇為每10 mL大孔吸附樹脂純化物為300 mg的PCX。

2.4.3 5%氨-甲醇用量的考察取大孔吸附樹脂純化物0.2 g,加甲醇溶解并稀釋至100 mL，量取上述溶液10 mL,置于盛有300 mg PCX 填料的燒杯中，按“2.4.1”進(jìn)行純化，通過進(jìn)行多次用小體積（10 mL）洗脫劑洗脫，將洗脫液進(jìn)HPLC分析，測(cè)定洗脫液中荷葉堿的濃度，結(jié)果見圖3（B）。由圖可知，荷葉堿的濃度在使用第1個(gè)10 mL洗脫劑時(shí)最大，說明大部分的荷葉生物堿類成分在第1個(gè)10 mL洗脫劑時(shí)被洗脫下來，且隨著洗脫劑體積的不斷增加，不斷有生物堿類成分被洗脫下來。但第4個(gè)10 mL（總量40 mL）洗脫劑中生物堿的峰面積非常小，說明通過前3個(gè)10 mL洗脫劑的洗脫，大部分生物堿都洗脫下來了。因此，綜合考慮到荷葉堿的洗脫率與實(shí)際操作，最終選擇30 mL 5%氨-甲醇進(jìn)行洗脫。

2.4.4 氨濃度的考察取大孔吸附樹脂純化物0.2 g,加甲醇溶解并稀釋至100 mL，量取上述溶液10 mL,置于盛有300 mg PCX 填料的燒杯中，按“2.4.1實(shí)驗(yàn)方法”進(jìn)行純化，分別加入30 mL 0.2%、2%、5%、10%氨-甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3（C）。由圖可知，當(dāng)氨水濃度在0%～5%變化時(shí)，隨著氨水濃度的增加，洗脫液中荷葉堿的濃度增加，說明在堿性條件下，荷葉堿從強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂中緩慢地被洗脫出來，在氨水濃度為5%時(shí)，峰面積達(dá)到最大。但當(dāng)氨濃度繼續(xù)增加至10%時(shí)，洗脫液中荷葉堿的峰面積并未見明顯增加，因此選擇5%為最佳氨濃度。

圖3 PCX的用量（A）、洗脫劑的體積（B）和氨濃度（C）對(duì)荷葉堿純化的影響

2.4.5 最佳條件的驗(yàn)證在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按“2.4.1”進(jìn)行純化，平行3次，得荷葉總生物堿純化物。取荷葉總生物堿純化物約6 mg，精密稱定，至100 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。荷葉堿的含量及轉(zhuǎn)移率結(jié)果見表1。

表1 荷葉總生物堿純化物中荷葉堿的含量及轉(zhuǎn)移率 %

3 討論

目前，對(duì)荷葉中生物堿類成分進(jìn)行純化的方法主要有溶劑萃取法、大孔吸附樹脂柱色譜法、離子交換柱色譜法等，而溶劑萃取法會(huì)使用大量的鹽酸、三氯甲烷等刺激性、毒性較大的溶劑，造成實(shí)驗(yàn)操作不便和環(huán)境污染等問題，而采用大孔吸附樹脂或離子交換樹脂柱色譜法進(jìn)行一次純化時(shí)，存在純化后荷葉生物堿純度不高的問題。本研究在采用大孔吸附樹脂初步純化后，采用分散固相萃取法進(jìn)行進(jìn)一步純化，分散固相萃取法與傳統(tǒng)的柱色譜法相比，具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，大大提高了純化的效率。

經(jīng)本方法制備所得的荷葉總生物堿純化物中生物堿類成分的含量較高，荷葉藥材中荷葉堿的含量約為0.085%，而總生物堿純化物中荷葉堿的含量可達(dá)30%，提高了約350倍。此外對(duì)總生物堿純化物中O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、蓮堿的含量也進(jìn)行了含量測(cè)定，三者的含量分別達(dá)到9.93%～11.36%、1.96%～2.99%、2.17%～2.67%。

本方法采用大孔吸附樹脂-分散固相萃取兩種方法結(jié)合，建立了荷葉中總生物堿成分的制備方法及對(duì)促進(jìn)荷葉資源的合理利用，加強(qiáng)荷葉減肥降脂其相關(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)具有重要的意義。