雷尼酸鍶對實驗性牙周炎大鼠牙周組織中OPG、RANKL 影響的研究*

梁向陽 李春年

前期的動物實驗研究已證實雷尼酸鍶作為骨質(zhì)疏松治療藥物，其輔助牙周局部治療可減少破骨細(xì)胞的形成，起到抑制牙槽骨吸收的作用，同時可促進(jìn)成骨細(xì)胞的再生，起到促進(jìn)牙槽骨再形成的作用[1]。已有研究證明，骨保護(hù)蛋白OPG/ 核因子-kB 受體活化因子配體RANKL/ 核因子-kB 受體活化因子RANK 信號通路在骨的改建過程中至關(guān)重要[2,3]，在本課題前期研究的基礎(chǔ)上，擬通過比較觀察雷尼酸鍶對大鼠實驗性牙周炎治療后牙周組織中骨代謝因子OPG、RANKL 的影響，更加深入地評估雷尼酸鍶對牙周炎大鼠的治療作用，為雷尼酸鍶輔助牙周治療提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠50 只(3 月齡，180～200g)，在標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境下喂養(yǎng)(12h 白天/ 夜晚，22±0.1℃)，飲食均為鼠糧和自來水。(以上均由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003，合格證編號：1607118)。

1.2 藥物及試劑 雷尼酸鍶(Sigma 公司，美國)；兔抗大鼠OPG 多克隆抗體、兔抗大鼠RANKL多克隆抗體、超敏二步法免疫組化檢測試劑PV9000(武漢博士德生物工程有限公司，中國)。

1.3 實驗方法 將50 只3 月齡雄性SD 大鼠隨機分為5 組(10 只/ 組)，1)正常組，2)牙周炎組，3)牙周炎局部治療組，4)牙周炎雷尼酸鍶治療組，5)牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組。采用正畸鋼絲結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙頸部建立大鼠牙周炎模型。結(jié)扎4 周后，除正常組外，其余4 組各隨機抽取2 只大鼠鑒定牙周炎模型，上頜第一磨牙牙齦紅腫，牙周袋形成，牙槽骨吸收，說明牙周炎模型建立成功。結(jié)扎8 周后，牙周炎局部治療組通過去除鋼絲、牙周袋局部上碘甘油建立牙周炎局部治療模型，牙周炎雷尼酸鍶治療組采取雷尼酸鍶400mg/ (kg·d)灌胃建立藥物治療模型，牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組去除鋼絲、牙周袋局部上藥，同時雷尼酸鍶灌胃。牙周炎局部治療和藥物治療8 周后處死所有大鼠，制作牙周組織連續(xù)切片，觀察牙周組織的改變情況；計量牙周附著喪失情況的變化；進(jìn)行免疫組化染色，觀察牙周組織中OPG、RANKL 的變化情況，評價雷尼酸鍶對牙周炎的治療效果。

1.4 組織化學(xué)切片制作與染色 將大鼠上頜骨標(biāo)本浸泡于10%福爾馬林中固定48h，流動水沖洗，置于PH 為7 的10%乙二胺四乙酸鈉脫鈣液中，4℃脫鈣2 個月，脫鈣成功后，修剪標(biāo)本，包埋，與第一磨牙的牙體長軸平行，從近遠(yuǎn)中方向連續(xù)切片，厚約5μm。HE 染色觀察牙周組織的變化。免疫組織化學(xué)染色，觀察牙周組織中OPG、RANKL 指標(biāo)的變化。

1.5 顯微鏡下組織學(xué)觀察 光鏡下觀察所有大鼠牙周組織的形態(tài)學(xué)改變及OPG、RANKL 免疫組織化學(xué)染色情況。

1.6 顯微圖象分析 在光鏡下，選取大鼠上頜第一磨牙遠(yuǎn)中根根中1/ 3 區(qū)牙齦及牙槽骨進(jìn)行測量(×400)，在該區(qū)域隨機選擇3 個部位，測量其光密度值，取平均值作為該指標(biāo)的平均光密度值(Average Optical Density，AOD)，用來評價牙槽骨的改變情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的方法進(jìn)行檢驗(檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)差異)。

2.結(jié)果

2.1 牙周組織觀察 正常組：牙齦顏色基本正常，未探及牙周袋；光鏡下觀察：牙槽嵴頂形態(tài)規(guī)則。

牙周炎組：牙齦重度紅腫，探診出血，可探及深牙周袋；光鏡下觀察：結(jié)合上皮向根方增殖，牙周結(jié)締組織內(nèi)可見大量的淋巴細(xì)胞浸潤，牙槽骨中出現(xiàn)較多破骨細(xì)胞性骨吸收陷窩，固有牙槽骨吸收破壞(圖1)。

圖1 牙周炎組牙周形態(tài)(HE×100，黑色箭頭指示破骨細(xì)胞)

牙周炎局部治療組：牙齦輕度紅腫，探診出血，可探及牙周袋；光鏡下觀察：結(jié)締組織內(nèi)少量炎性細(xì)胞，牙槽骨破壞處可見大量的成骨細(xì)胞。

牙周炎雷尼酸鍶治療組：牙齦中度紅腫，探診出血，可探及深牙周袋；光鏡下觀察：牙周結(jié)締組織中炎性細(xì)胞浸潤，牙槽骨中可見少量的破骨細(xì)胞，牙槽骨吸收處可見較多的成骨細(xì)胞。

牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組：牙齦略紅腫，探診出血，牙周袋變淺；光鏡下觀察：牙周結(jié)締組織內(nèi)少量的炎性細(xì)胞浸潤，牙槽骨破壞處可見較多的成骨細(xì)胞(圖2)。

圖2 牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組牙周形態(tài)(HE×100，黑色箭頭指示成骨細(xì)胞)

2.2 大鼠牙周組織中OPG 的表達(dá) OPG 的表達(dá)主要位于成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其陽性部位為棕色或棕黃色顆粒。正常組，OPG 的表達(dá)較輕微，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組OPG 表達(dá)均比牙周炎組表達(dá)升高，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組中OPG 表達(dá)明顯升高，比牙周炎組、牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組表達(dá)均明顯升高，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖3，表1)。

圖3 大鼠牙周組織OPG 免疫組織化學(xué)染色(×400)

2.3 大鼠牙周組織RANKL 免疫組織化學(xué)染色 RANKL 的表達(dá)主要位于成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其陽性部位為棕色或棕黃色顆粒。正常組，RANKL 的表達(dá)較輕微，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組RANKL 的表達(dá)均比牙周炎組表達(dá)降低，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組可見RANKL 的表達(dá)較少，比牙周炎組、牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組表達(dá)均明顯降低，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖4，表1)。

表1 各組大鼠牙周組織中OPG和RANKL表達(dá)的平均光密度值(n=10，)

表1 各組大鼠牙周組織中OPG和RANKL表達(dá)的平均光密度值(n=10，)

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，△P＜0.05；與C 組比較；#P＜0.05；與D 組比較，※P＜0.05。

圖4 大鼠牙周組織RANKL 免疫組織化學(xué)染色(×400)

3.討論

牙周炎是發(fā)生于牙周組織的慢性炎癥性疾病，是成人牙齒缺失的主要原因之一。牙槽骨吸收是牙周炎患者牙齒丟失的主要病理機制[4]。雷尼酸鍶是臨床常用的抗骨質(zhì)疏松藥物，能夠促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，有利于骨質(zhì)的形成[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，實驗性牙周炎模型組牙槽嵴頂處骨吸收，牙槽骨中出現(xiàn)活躍的破骨細(xì)胞性骨吸收陷窩，固有牙槽骨破壞，提示牙槽骨破壞是牙周炎重要表現(xiàn)之一。HE 染色顯示牙周炎局部治療、雷尼酸鍶治療牙槽骨吸收處可見較多的成骨細(xì)胞，并且聯(lián)合治療情況明顯好于單純治療。這與陳河林等[7]研究結(jié)果相似，提示雷尼酸鍶聯(lián)合治療更有利于促進(jìn)牙周炎牙槽骨骨重建，改善預(yù)后。

牙槽骨重建是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞動態(tài)調(diào)節(jié)的結(jié)果，并且破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨吸收的時間明顯短于成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨形成的時間[8]。因此，抑制牙槽骨丟失的關(guān)鍵是抑制破骨細(xì)胞的作用。RANKL 是破骨細(xì)胞活化增殖過程的關(guān)鍵分子[9]，多種刺激因素，如炎癥[10]、活性氧[11]、應(yīng)力改變[12]等可刺激細(xì)胞表達(dá)RANKL，與破骨細(xì)胞表面RANK 受體結(jié)合，激活破骨細(xì)胞活性。在本研究中，我們通過免疫組化的方法證實了，牙周炎大鼠RANKL 表達(dá)范圍增加，并且雷尼酸鍶聯(lián)合治療組RANKL 表達(dá)量明顯低于單純牙周治療及雷尼酸鍶治療組。這一點與Pinto 等人的研究是相似的[13]。

OPG 是一種由成骨細(xì)胞分泌的糖蛋白，其發(fā)揮作用機制一方面與膜受體RANK 競爭性結(jié)合RANKL[14]；另一方面是影響RANKL 轉(zhuǎn)運至胞膜，使RANKL 留在胞內(nèi)[15]，減少RANKL/ RANK 信號，從而抑制骨破骨細(xì)胞激活。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，實驗性牙周炎大鼠牙周組織OPG 表達(dá)范圍明顯減少，牙周單純治療、雷尼酸鍶治療以及雷尼酸鍶聯(lián)合治療均增加了OPG 表達(dá)，并且雷尼酸鍶治療聯(lián)合治療明顯優(yōu)于單純治療，這一結(jié)果支持HE 染色發(fā)現(xiàn)牙槽骨吸收處可見較多的成骨細(xì)胞，Marins[16]等人的發(fā)現(xiàn)也支持我們的結(jié)果。

綜上所述，雷尼酸鍶能抑制牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收，促進(jìn)骨重建，為今后臨床上采用牙周基礎(chǔ)治療聯(lián)合雷尼酸鍶改善牙周炎患者的預(yù)后提供了理論依據(jù)和實驗參考。