酸水解法測定大豆中脂肪含量的方法優(yōu)化

張 瀾，賀文娟，徐美鑫，石 盟

（日照市質(zhì)量檢驗檢測研究院，山東日照 276800）

脂肪是食品標(biāo)準(zhǔn)中常見的檢驗項目，是營養(yǎng)標(biāo)簽之一[1]，不同食品的脂肪測定方法也不同。大豆富含豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及膳食纖維，具有藥食兩用的價值。大豆中脂肪含量測定適用于GB 5009.6—2016[2]。目前，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）中規(guī)定了4 種檢驗方法，大豆適用于第一法索氏抽提法和第二法酸水解法，索氏抽提法測定的是游離態(tài)脂肪含量，酸水解法測定的是游離態(tài)和結(jié)合態(tài)脂肪的總含量。酸水解法更能反映出大豆中脂肪含量。但GB 5009.6—2016 酸水解法的操作方法籠統(tǒng)[3]，檢測結(jié)果平行性差，結(jié)果不穩(wěn)定[4]。

為了準(zhǔn)確測定大豆的脂肪含量，對GB 5009.6—2016 酸水解法進(jìn)行方法優(yōu)化，優(yōu)化后的檢測結(jié)果更為穩(wěn)定可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器

AG285 型分析天平（0.1 mg），梅特勒-托利多儀器產(chǎn)品；具塞圓底試管（100 mL）、試管（50 mL）、具塞量筒（100 mL）；恒溫水浴鍋：室溫～99.9 ℃；BGZ-240 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（室溫～300 ℃），上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

鹽酸（AR）、無水乙醇（AR）、乙醚（AR）、石油醚（AR）、沸程30～60 ℃、三級水。

1.3 試驗材料

普通大豆樣品，市售；大豆粉質(zhì)控樣。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

稱取樣品2～5 g，置于100 mL 具塞圓底試管內(nèi)，加入8 mL 水，混勻后再加10 mL 鹽酸（2 mol/L）。將試管放入70～80 ℃水浴中，每隔5～10 min，以玻璃棒攪拌1 次，至試樣消化完全為止，需要40～50 min。

1.4.2 抽提

取出試管，加入10 mL 乙醇，混合。冷卻后以25 mL 無水乙醚分?jǐn)?shù)次清洗玻璃棒，待無水乙醚全部倒入量筒后，加塞振搖1 min，小心開塞，放出氣體，再塞好，靜置12 min，小心開塞，并用乙醚沖洗塞及量筒口附著的脂肪。靜置10～20 min，待上部液體清晰，用一次性吸管吸出上清液于已恒質(zhì)量的錐形瓶內(nèi)，再加5 mL 無水乙醚于具塞量筒內(nèi)，振搖，靜置后仍將上層乙醚吸出，放入原錐形瓶內(nèi)。

1.4.3 稱量

水浴上蒸干，于100±5 ℃條件下干燥1 h，放干燥器內(nèi)冷卻0.5 h 后稱量。重復(fù)以上操作直至恒重（直至2 次稱量的差不超過2 mg）。

1.4.4 計算

計算方法同國標(biāo)，此略。

1.5 試驗條件優(yōu)化

1.5.1 樣品制備優(yōu)化

大豆粉碎后分別過20，40，60，80 目篩，得到粒度不同的4 種粉碎后樣品，按照1.4 分別進(jìn)行脂肪含量測定，研究大豆粒度對脂肪抽提的影響，選擇最優(yōu)粒度進(jìn)行含量測定。

1.5.2 試樣稱量及處理過程

按照GB 5009.6 進(jìn)行大豆脂肪含量提取時，試驗稱量所用容器具及處理過程直接影響脂肪的回收率，因此進(jìn)行試樣稱量及處理過程優(yōu)化試驗。

分別按照標(biāo)準(zhǔn)方法（即樣品稱取到50 mL 試管，水解后轉(zhuǎn)移至100 mL 具塞量筒）、樣品直接稱取到100 mL 具塞量筒、樣品直接稱取到100 mL 具塞圓底試管，3 種前處理進(jìn)行試驗。

1.5.3 抽提溶劑優(yōu)化

分別選用乙醚、乙醚∶石油醚（1∶1）、石油醚等溶劑進(jìn)行脂肪抽提，以期選擇最佳的抽提溶劑。

1.5.4 抽提次數(shù)優(yōu)化

按照GB 5009.6 進(jìn)行大豆脂肪含量提取時，脂肪抽提次數(shù)是大豆脂肪含量測定的關(guān)鍵影響因素。因此實驗室分別進(jìn)行2，3，4 次溶劑抽提，以期選擇最優(yōu)抽提次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理

不同粒度大豆粉脂肪含量測定見表1。

表1 不同粒度大豆粉脂肪含量測定 /%

由表1 可知，大豆粒度從20～80 目，目數(shù)越大粒度越小，其脂肪測定值越大。20，40 目的大豆粉脂肪含量測定值分別為11.9%，14.8%遠(yuǎn)小于60 目（16.8%）和80 目（17.1%）的大豆粉；而60 目與80 目的大豆粉脂肪測定值相近，所以在大豆樣品制備中應(yīng)選擇60 目以上的大豆粉碎樣品進(jìn)行脂肪含量測定。

2.2 試樣稱量及處理過程

不同稱量及處理過程大豆粉脂肪含量測定見表2。

表2 不同稱量及處理過程大豆粉脂肪含量測定 /%

由表2 可知，3 種不同的試樣稱量及處理過程，樣品由50 mL 試管轉(zhuǎn)移至100 mL 具塞量筒的處理過程，有中間轉(zhuǎn)移步驟，大豆粉脂肪測定值為15.1%，低于沒有轉(zhuǎn)移步驟的大豆粉脂肪測定值（16.1%，16.6%），說明脂肪在轉(zhuǎn)移過程中有損耗。

樣品直接稱取到100 mL 具塞量筒處理過程的RSD 值大于樣品直接稱取到100 mL 具塞圓底試管處理過程的RSD 值，即使用具塞圓底試管的平行性優(yōu)于使用具塞量筒。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，具塞量筒底部為直角，加水混勻時大豆粉易在直角處堆積，無法用水溶解，具塞圓底試管底部為圓弧型，加水溶解大豆粉不易堆積。所以，在試樣稱量處理過程中應(yīng)選擇樣品直接稱取到100 mL 具塞圓底試管中。

2.3 抽提試劑

不同抽提溶劑大豆粉脂肪含量測定見表3。

表3 不同抽提溶劑大豆粉脂肪含量測定 /%

3 種試劑抽提大豆粉脂肪測定值對比，乙醚（16.7%）＞乙醚：石油醚=1∶1（12.8%）＞石油醚（10.1%），石油醚溶解脂肪能力比乙醚低，石油醚的提取效率低于乙醚，所以抽提溶劑應(yīng)選擇乙醚。

2.4 抽提次數(shù)

不同抽提次數(shù)大豆粉脂肪含量測定見表4。

表4 不同抽提次數(shù)大豆粉脂肪含量測定 /%

由表4 可知，抽提2 次的大豆粉脂肪測定值（15.4%）明顯小于抽提3 次（16.9%）和4 次（17.0%）的大豆粉脂肪測定值，而抽提3 次和抽提4 次大豆粉脂肪測定值相差不大，所以在大豆粉脂肪含量測定中應(yīng)選擇抽提3 次進(jìn)行試驗。

2.5 條件優(yōu)化前后對比

為了驗證優(yōu)化的試驗條件，購買了大豆粉中脂肪含量質(zhì)控樣品，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)方法與優(yōu)化后的方法進(jìn)行比較。

條件優(yōu)化前后大豆粉脂肪含量測定見表5。

表5 條件優(yōu)化前后大豆粉脂肪含量測定 /%

使用市售大豆粉質(zhì)控樣（脂肪指定值為16.99%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.47%）對試驗條件優(yōu)化進(jìn)行驗證，質(zhì)控樣品測試結(jié)果評價方法采用“Z-比分?jǐn)?shù)”評價，當(dāng)ⅠZⅠ≤2，測試結(jié)果為滿意；當(dāng)2＜ⅠZⅠ＜3，測試結(jié)果為可疑。條件優(yōu)化前大豆粉脂肪測定值為15.6%，Z值為2.96，測試結(jié)果可疑。

由表5 可知，條件優(yōu)化后大豆粉脂肪測定值為16.3%，Z值為1.47，測試結(jié)果滿意。

3 結(jié)論

脂肪作為食品檢測行業(yè)中的一個重要指標(biāo)，準(zhǔn)確測定脂肪含量具有非常重要的意義。對酸水解測定大豆粉中脂肪含量的檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，綜合條件優(yōu)化前后數(shù)據(jù)來看，大豆樣品制備中應(yīng)選擇60 目以上的大豆粉碎樣品，脂肪提取效果更好；樣品直接稱取到100 mL 具塞圓底試管，減少了轉(zhuǎn)移過程中的損失，平行性更好；溶劑抽提3 次，脂肪基本上能夠抽提完全。值得注意的是，通過幾種抽提溶劑比對發(fā)現(xiàn)，選用標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.6—2016 中所用抽提溶劑（即乙醚），其抽提效果最好。通過對大豆粉質(zhì)控樣檢測對比，優(yōu)化后的檢測方法Z 值為1.47，結(jié)果滿意，此時脂肪含量測定值更接近指定值。

酸水解法測定大豆脂肪含量優(yōu)化后的檢測方法，脂肪提取效果更徹底，損耗低，平行性、精密度優(yōu)于原方法；對今后實驗室進(jìn)行酸水解法測定大豆粉中脂肪含量提供了可靠的試驗數(shù)據(jù)，具有一定的指導(dǎo)作用。