QuEChERS-UPLC-MS/MS 法測定獼猴桃中12 種農(nóng)藥殘留的研究

程 瀧， 黃 露，馮 吉，吳 玉，邱棟樑

（1.德陽市食品藥品安全檢驗檢測中心，四川德陽 618000；2.德陽市食品檢驗重點實驗室，四川德陽 618000）

0 引言

獼猴桃是獼猴桃科獼猴桃屬植物，其果肉質(zhì)地柔軟、口感酸甜，深受消費者喜愛，中國是獼猴桃的原產(chǎn)地，在種植過程中，也會存在一些病蟲害，造成獼猴桃產(chǎn)量的損失，主要病害有潰瘍病、炭疽病、膏藥病、軟腐病、灰霉病、根腐病、褐斑病及生理性缺素癥等，蟲害有小薪甲、葉蟬、斜紋夜蛾、紅蜘蛛、介殼蟲、根結(jié)線蟲、蝽類等。同其他水果一樣，獼猴桃在生長過程中使用化學(xué)農(nóng)藥是防治病蟲害的重要手段和措施，殺蟲劑、殺菌劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、保鮮劑等的使用比較普遍[1-3]。近年來，我國獼猴桃種植面積擴大，各主要獼猴桃產(chǎn)區(qū)病蟲害發(fā)生的頻次有所增加，以至于農(nóng)藥使用增多。為了防止生產(chǎn)上存在濫用、超劑量使用造成農(nóng)藥殘留超標的情況，給獼猴桃質(zhì)量安全帶來一定的隱患，影響消費者健康，因此有必要對目前市場流通環(huán)節(jié)中獼猴桃產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留狀況進行監(jiān)控。

現(xiàn)行國家標準檢驗方法為GB/T 20769—2008[4]水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留量分析的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。但該方法前處理操作繁瑣、消耗大量，對環(huán)境有污染的試劑如乙腈、甲苯這樣的有機溶劑，不適合大批樣品的快速定性及定量分析。ANASTASSI-ADES 等于2003 年首次提出QuEChERS 前處理方法，與固相萃取柱凈化法相比，具有前處理高效快捷、溶劑用量少、樣品制備簡便、回收率良好，可同時處理大批量樣品等優(yōu)點，在農(nóng)藥殘留分析中得到廣泛的應(yīng)用[5-12]。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer，UPLC-MS/MS）對于基質(zhì)復(fù)雜、干擾嚴重的痕量化合物能夠在短時間進行定性定量分析。使用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，以獼猴桃作為研究對象，對QuEChERS 前處理凈化劑的選擇、色譜條件、樣品復(fù)溶溶劑等做了優(yōu)化研究，以構(gòu)建一種能有效去除色素、糖類等雜質(zhì)干擾因素，能用于獼猴桃中農(nóng)藥殘留快速檢測并節(jié)約成本的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀。Agilent 1290 型超高效液相色譜儀，美國安捷倫公司產(chǎn)品；QTRAP 4500 三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜，配有電噴霧離子源（ESI）、MultiQuantTM 定量軟件，美國AB SCIEX 公司產(chǎn)品；MS205DU 型電子天平，瑞士Mettler-Toledo 公司產(chǎn)品；MTN-5800A 型氮吹濃縮裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；VG3 S025 型渦旋振蕩器，德國IKA 公司產(chǎn)品；HLS-1053 型組織破碎機，深圳海力士公司產(chǎn)品；TGL-16A 型臺式高速冷凍離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

（2）12 種農(nóng)藥標準溶液。吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、烯酰嗎啉、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、辛硫磷、霜霉威、敵百蟲、殺蟲脒、唑蟲酰胺、噻蟲嗪、噻蟲胺（1 000 μg/mL）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，45 μm），北京振翔科技有限公司提供；乙腈、甲醇（色譜純），德國Merck 公司提供；甲酸（優(yōu)級純），成都科隆化學(xué)品有限公司提供；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純），成都科龍化工試劑廠提供；石墨化炭黑（GCB，45 μm），北京振翔提供；尼龍微孔濾膜，天津津騰公司實驗設(shè)備有限提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

（1）混合標準使用液。分別精密量取不同質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL 的標準溶液逐級稀釋得混合標準使用液（質(zhì)量濃度為吡蟲啉400 ng/mL，啶蟲脒400 ng/mL，多菌靈400 ng/mL，烯酰嗎啉200 ng/mL，甲氨基阿維菌素174.8 ng/mL，辛硫磷20 000 ng/mL，霜霉威50 ng/mL，敵百蟲200 ng/mL，唑蟲酰胺50 ng/mL，殺蟲脒1 000 ng/mL，噻蟲嗪5 000 ng/mL，噻蟲胺 10 000 ng/mL）。

（2）標準工作曲線。精密量取混合標準使用液0.01，0.02，0.04，0.10，0.20 mL 用空白樣品提取液定容至2.00 mL 制得標準工作曲線。

1.2.2 樣品處理

獼猴桃去柄取全果，打碎混勻。稱取10 g 試樣于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈和2 g 氯化鈉，渦旋振蕩器上混合3 min 后置于離心機中以轉(zhuǎn)速7 000 r/min 離心5 min 分層。

取5 mL 上層有機相加入到內(nèi)含150 mg PSA、30 mg 石墨化炭黑（GCB）和600 mg 無水硫酸鎂的50 mL 離心管中。渦旋振蕩器上混合1 min 后置于離心機中以轉(zhuǎn)速7 000 r/min 離心2 min，將全部上清液過0.45 μm 有機微孔濾膜到10 mL 試管中40 ℃水浴氮吹至干。用1.00 mL 的0.1%甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）復(fù)溶后渦旋振蕩器上混勻，過0.22 μm 有機微孔濾膜于進樣瓶中待測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18RRHD（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；進樣體積10 μL；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈；流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃。

梯度洗脫條件見表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM），電噴霧電壓（IS）：5 500 V，碰撞氣（CAD）：Medium，離子源溫度（TEM）500 ℃。

12 種農(nóng)藥的特征離子參考質(zhì)譜條件見表2。

表2 12 種農(nóng)藥的特征離子參考質(zhì)譜條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和Origin 8.5 進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件的優(yōu)化

為了除去樣品中的色素及其他雜質(zhì)，降低基質(zhì)干擾，減少樣品在進樣過程中對色譜柱和離子源的污染，對QuEChERS 法常使用的3 種凈化劑：PSA、Z-Sep+、石墨化炭黑（GCB）進行篩選。PSA 由硅膠鍵合乙二胺基-N-丙基得到一種固相吸附劑，具有2 個氨基，有去除糖、有機酸、脂肪酸、花青素色素、金屬離子等的能力。Z-Sep+是一種在硅膠基質(zhì)表面雙重鍵合了C18和Z-Sep+（二氧化鋯涂層的二氧化硅）的新型填料，對甘油酯和磷脂具有很強的吸附力，可以用于凈化脂肪含量大于15%的樣品。石墨化炭黑（GCB）可以有效去除色素和固醇類雜質(zhì)。分別稱取PSA、Z-Sep+、GCB 3 種凈化劑各30，100，150，300，500 mg，加入5 mL 空白樣品提取液和600 mg 無水硫酸鎂，再加入12 種農(nóng)藥標準使用液，考查這3 種凈化劑各自作用效果，通過回收率考查及觀察樣本顏色變化考查凈化劑對目標物的吸附情況及去除色素雜質(zhì)的效果。150 mg PSA 農(nóng)藥回收率在60%～81%，300 mg 以上總體回收率開始下降，并且無明顯除色素作用。對于GBC 加入100 mg的樣品雖然色素能夠部分去除，但是多菌靈回收率只有42%，原因可能是其六元環(huán)結(jié)構(gòu)會吸附對稱結(jié)構(gòu)及平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，導(dǎo)致回收率降低[13-14]。而加入100 mg 的Z-Sep+的樣品中多菌靈、殺蟲脒、敵百蟲有明顯吸附，回收率分別只有38%，46%，50%?？赡苁寝r(nóng)藥有羥基（-OH）、氨基（-NH2）等官能團，可與Z-Sep+含有的氧化鋯（ZrO2）發(fā)生路易斯酸-堿作用，從而導(dǎo)致農(nóng)藥損失[15]?？紤]到獼猴桃樣本脂肪類含量少但有大量色素及糖類等雜質(zhì)的存在，最終使用內(nèi)含600 mg 無水硫酸鎂、150 mg PSA 及30 mg GCB 的QuEChERS 凈化劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為了得到較好分離度的農(nóng)藥色譜峰、避免雜質(zhì)與檢測農(nóng)藥共同進入離子源造成基質(zhì)效應(yīng)干擾影響試驗，所以對流動相及比例優(yōu)化。因為檢測的12 種農(nóng)藥均為正離子模式，為了提高離子化效率以0.1%的甲酸水溶液為水相。再篩選甲醇和乙腈作為有機流動相。當用甲醇作為流動相可以使各農(nóng)藥色譜峰有很好的分離度，但是柱壓較高，不利于色譜柱和設(shè)備的運行，如果降低流速可減小柱壓但又增加了檢測時間，不利于快速檢測，以乙腈為流動相大部分出峰時間較快，柱壓較低，0.5 mL/min 流速柱壓也只有400 bar，這樣減少檢測時間，調(diào)整水相與乙腈比例后農(nóng)藥色譜峰也能得到較好分離度。

12 種農(nóng)藥的總離子流色譜圖見圖1，12 種農(nóng)藥化合物定量離子色譜圖見圖2。

圖1 12 種農(nóng)藥的總離子流色譜圖

圖2 12 種農(nóng)藥化合物定量離子色譜圖

2.3 復(fù)溶溶劑的考察

超高效液相色譜儀在使用1.8 μm 的C18色譜柱進樣過程中通常都用較小的流速進行試驗，這樣溶劑效應(yīng)的影響尤為明顯。為了獲得較好的色譜峰形并且減少溶劑效應(yīng)，樣品前處理時所使用的樣品復(fù)溶溶劑多為初始流動相，而在試驗中發(fā)現(xiàn)如果用0.1%的甲酸水溶液∶乙腈（9∶1）復(fù)溶過濾后，檢測辛硫磷、甲氨基阿維菌素、唑蟲酰胺極性小的農(nóng)藥回收率小于20%，樣品溶液過濾膜后顏色很淺，可能原因是色素等雜質(zhì)在被濾膜截留的同時對極性較小農(nóng)藥有部分吸附導(dǎo)致回收率低。而用0.1%的甲酸水溶液∶乙腈（1∶1）復(fù)溶過濾后檢測，雖然辛硫磷、甲氨基阿維菌素、唑蟲酰胺回收率大于60%，但是霜霉威、多菌靈、殺蟲脒、噻蟲嗪這樣極性較大的農(nóng)藥因為溶劑效應(yīng)出峰呈現(xiàn)“M”型的色譜峰不利于定量，且樣品溶液顏色較深。最終選用0.1%的甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）溶液復(fù)溶過濾，回收率均大于60%，溶液顏色較淺。通過試驗得知選擇合適復(fù)溶液過濾后既能再次除部分殘留色素，又能保證峰形完整和檢測的回收率。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)是由待測物質(zhì)被共流出的其他雜質(zhì)組分，影響電噴霧電離過程中的離子化所致，表現(xiàn)為基質(zhì)增強或抑制作用。獼猴桃中含有的色素、糖類、維生素等內(nèi)源物質(zhì)，均為農(nóng)藥殘留檢測過程中基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的來源[16-20]。試驗通過比對同濃度基質(zhì)配制的標準溶液和定容溶劑0.1%的甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）配制的標準溶液的儀器檢測峰面積比值來評價基質(zhì)效應(yīng)，即基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標準溶液峰面積/溶劑標準溶液峰面積?；|(zhì)效應(yīng)大于1 為基質(zhì)增強效應(yīng)，反之則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。

獼猴桃中12 種農(nóng)藥基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應(yīng)見表3。

表3 獼猴桃中12 種農(nóng)藥基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應(yīng)

由表3 可知，獼猴桃中12 種農(nóng)藥均呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，且霜霉威、敵百蟲、辛硫磷基質(zhì)抑制較為明顯，所以采用獼猴桃基質(zhì)稀釋標準溶液作工作曲線來校正獼猴桃基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 方法的線性關(guān)系、檢出限、回收率和相對標準偏差

使用獼猴桃陰性樣品提取液，稀釋12 種農(nóng)藥的混合標準溶液配制成基質(zhì)標準曲線，在優(yōu)化好的UPLC-MS/MS 儀器條件下進行測定。各農(nóng)藥組分定量離子的峰面積做為縱坐標，各農(nóng)藥組分的質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制校準工作曲線。以3 倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）。以3 個不同質(zhì)量濃度做加標回收試驗，每個質(zhì)量濃度點測定6 次，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD）。獼猴桃中12 種農(nóng)藥質(zhì)量濃度為0.25～2 000 ng/mL 時，相關(guān)系數(shù)大于0.995 9，該方法檢出限為0.02～1.50 μg/kg。在不同添加量下，12 種農(nóng)藥平均回收率為61.5%～81.5%，相對標準偏差為3.0%～10.2%，試驗結(jié)果可信。

12 種農(nóng)藥的線性特征、檢出限見表4，獼猴桃中12 種農(nóng)藥組分的回收率和相對標準偏差（n=6）見表5。

表4 12 種農(nóng)藥的線性特征、檢出限

表5 獼猴桃中12 種農(nóng)藥組分的回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結(jié)論

基于QuEChERS 凈化前處理對獼猴桃中12 種農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。相比于國標方法GB/T 20769—2008，該方法簡便、快速、凈化效果好，有較好回收率，更加節(jié)約時間和成本，適用于獼猴桃中農(nóng)藥快速篩查，對推動獼猴桃主要產(chǎn)區(qū)農(nóng)藥殘留調(diào)查有積極意義，還可進一步探究其他水果蔬菜中農(nóng)藥快速檢測的可行性。