水楊酸微膠囊對酪氨酸酶的抑制作用

粟艷婷，張 健，王少茹，宋曉秋，李婷婷

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 200418）

水楊酸（SA）是一種脂溶性有機(jī)酸，廣泛存在于植物內(nèi)源的小分子酚類化合物，20 世紀(jì)70 年代水楊酸開始用于蔬果保鮮[1]。試驗(yàn)表明，使用一定濃度的SA 溶液對辣椒、油桃和番茄農(nóng)作物進(jìn)行涂抹或浸泡保鮮處理，可以延長蔬果在室溫下的貯藏時間，起到保鮮的作用[2-4]。此外，SA 是生物膜穩(wěn)定劑，可延緩動物衰老，醫(yī)學(xué)上用于治療或預(yù)防解熱鎮(zhèn)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，有著廣泛的應(yīng)用空間[5-6]。Pushpa K 等人[7]使用1.0 mmol/L SA 與2%殼聚糖聯(lián)合處理采后荔枝果實(shí)可以有效抑制果皮褐變，提高荔枝果實(shí)的保藏品質(zhì)。付云云等人[8]研究表明，15 mmol/L SA 溶液處理仔姜保鮮效果較好，能夠有效防止其腐敗，延長貨架期。已有的一些果實(shí)保鮮研究表明SA作用與抑制酪氨酸酶的活性有關(guān)。李曉鶯等人[9]用SA溶液處理枸杞鮮果后，其多酚氧化酶活性明顯降低。Dan Z 等人[10]報(bào)道SA 質(zhì)量濃度高于0.3 g/L 時可顯著抑制酪氨酸酶活性，其抑制機(jī)制為SA 與酪氨酸酶結(jié)合使其失活，進(jìn)而達(dá)到抑制果蔬褐變。果實(shí)在貯藏過程中發(fā)生褐變的內(nèi)部因素主要是由于體內(nèi)的酚類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，果實(shí)內(nèi)的酚物質(zhì)含量、多酚氧化酶的活性和氧氣的供應(yīng)是果實(shí)產(chǎn)生褐變的三大基本條件[11]。酪氨酸酶也稱多酚氧化酶（PPO），多酚氧化酶是一種重要的末端氧化酶，在熱帶水果的保鮮、貯運(yùn)及加工過程中，該酶是引起果蔬酶促褐變的主要酶類，嚴(yán)重影響了制品的營養(yǎng)、風(fēng)味及外觀品質(zhì)[12]。因此，通過對酪氨酸酶的測定能從這一指標(biāo)上考查物質(zhì)對褐變性能促進(jìn)或抑制。如果多酚氧化酶的活性降低，可以間接地抑制果實(shí)發(fā)生褐變，保持果實(shí)的商品價值。

水楊酸雖然在蔬果保鮮上有應(yīng)用前景，但由于水楊酸的酸性強(qiáng)、溶解性小和刺激性味道較大，而且使用濃度越大刺激性味道越重，直接將水楊酸溶液用于果實(shí)保鮮一是無法做到均勻溶解，二是會殘留刺激性味道，使用難度大。也有研究報(bào)道將水楊酸進(jìn)行?；纬梢阴Ｋ畻钏?，乙酰水楊酸無臭，微溶于水，乙酰水楊酸在組織內(nèi)易發(fā)生水解轉(zhuǎn)化為SA發(fā)揮保鮮作用[13-14]。但是，乙酰水楊酸需要先經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)合成，成本較高。針對SA 水溶性差，導(dǎo)致藥性不理想，并且異味、刺激性太強(qiáng)這些問題，將SA制備成微膠囊以增加其水溶性和減小其刺激性味道，提高SA 的使用效率和增大其使用范圍。微膠囊是利用天然的或合成的高分子成膜材料（壁材）將氣體、液體或固體的微小顆粒（芯材）包裹在具有半透性或密封囊膜里，包合物對囊內(nèi)的活性成分具有保護(hù)、穩(wěn)定、傳遞及緩釋等作用[15-16]。目的是將SA 和壁材制成微膠囊后，提高其溶解度、穩(wěn)定性，微膠囊的緩釋特性也可以延長藥效，同時降低水楊酸的刺激性，掩蓋其氣味[17-18]。在制備得到水楊酸微膠囊（SAM）的基礎(chǔ)上研究SA 及SAM溶液抑制酪氨酸酶活性的效果，并以探討SA 及其微膠囊對抑制褐化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-酪氨酸（Purity≥99%），Ruibio 公司提供；酪氨酸酶（25 kU，純度為99.9%），Worthington Biochemical 公司提供；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、水楊酸（SA，分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙腈（HPLC 級，≥99.9%）、甲醇（HPLC 級，≥99.9%），Adamas-beta公司提供；甲酸（色譜純），Spring&Autumn 公司提供。香蕉品種為芝麻蕉（Musa sapientum fixa sesamae）；初始品質(zhì)指標(biāo)，購自上海華聯(lián)超市；要求無病蟲害、大小均勻、八成熟，數(shù)量為8 組。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent LC 1260 型高效液相色譜儀，Agilent Technologies 公司產(chǎn)品；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，邦西儀器科技（上海）有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型數(shù)顯酸度計(jì)，上海越平有限公司產(chǎn)品；AL104 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；1620QT 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；TECAN Infinite M200PRO 型多功能酶標(biāo)儀，奧地利帝肯有限公司產(chǎn)品；NH310 型高品質(zhì)電腦色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司產(chǎn)品；移液槍（20～200 μL，100～1 000 μL），多道移液槍（1～10 μL），上海泰坦化學(xué)有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 水楊酸微膠囊（SAM）制備

根據(jù)專利文獻(xiàn)[19]的方法制備SAM，稱取2.0 g SA 和0.2 g 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的磷酸鈉溶液，加入5 倍丙二醇將SA 溶解均勻，稱取司盤-80 和吐溫-80 各0.1 g，加入到上一步溶解均勻后所得的SA 溶液中，在高剪切分散乳化機(jī)的作用下以轉(zhuǎn)速15 000 r/min 均質(zhì)乳化數(shù)分鐘。稱取β -環(huán)糊精6.0 g 溶于去離子水中制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%的β -環(huán)糊精水溶液，然后加入1 g 羧甲基纖維素鈉溶解均勻制作壁材；將上述步驟所得的SA 乳化液加入到壁材溶液中反應(yīng)2 h，反應(yīng)溫度為45 ℃，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫后靜置，經(jīng)過濾、洗滌、干燥，得到裝載SA 的復(fù)合壁材微膠囊。

2.2 SA 含量的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[20]，使用改進(jìn)的條件測試SA 含量，通過方法考查后SA 的測定及其標(biāo)準(zhǔn)曲線制作采用以下色譜條件：色譜柱4.6 mm×150 mm 色譜柱，吸收波長300 nm，柱溫35 ℃，流動相0～2 min 時，30%乙腈：70% 水（含0.1%甲酸）；12 min 時，80%乙腈：20%水（含0.1%甲酸），流速1 mL/min；時間20 min，進(jìn)樣量5.00 μL。

2.3 SA 包埋率的測定

精準(zhǔn)稱取SAM 3.0 mg，先加入少量甲醇，然后用超聲的方法（時間10 min，功率50 W）進(jìn)行處理，使SAM充分溶解破壁釋放出SA，最后用甲醇定容于10 mL 容量瓶中。通過與制作的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，確定水楊酸微膠囊中水楊酸含量及包埋率。

包埋率計(jì)算見公式（1）：

2.4 酪氨酸酶抑制率的測定

用移液槍分別在EP 管中加入L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS 緩沖液（pH=6.8）1 000 μL，再依次分別加入不同濃度2 000，1 000，500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.82 nmol/L 的SA 或SAM 溶液100 μL，混合后，用移液槍分別取混合液150 μL 置于96 孔板內(nèi)，標(biāo)注為樣品溶液C。待放入酶標(biāo)儀時，再用多道移液槍快速加入10 μL 酪氨酸酶溶液。在96 孔板的空白處加入3 種對照溶液，對照溶液A 為L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS 緩沖液1 000 μL，加入去離子水100 μL，混合。取對照溶液A 150 μL 置于96 孔板內(nèi)，待放入酶標(biāo)儀時再加入酪氨酸酶溶液10 μL。對照溶液B 為L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS緩沖液1 000 μL，加入去離子水100 μL，混合。取對照溶液B 150 μL置于96 孔板內(nèi)，待放入酶標(biāo)儀時，不再加入酪氨酸酶溶液。對照溶液D 為L-酪氨酸溶液500 μL 和PBS 緩沖液1 000 μL，加入不同濃度的SA（或SAM）溶液100 μL，混合。取對照溶液D150 μL置于96 孔板內(nèi)，待放入酶標(biāo)儀時，不再加入酪氨酸酶溶液。根據(jù)文獻(xiàn)[21]，使用酶標(biāo)儀于波長475 nm 處測定吸光度，每個樣品做3 個平行測定，前30 min，每隔4 min 測定1 次；后30 min，每隔15 min 測定1 次，共測定1 h。

酪氨酸酶抑制率計(jì)算見公式（2）：

式中：ODA——對照溶液A 吸光度；

ODB——對照溶液B 吸光度；

ODC——樣品溶液C 吸光度；

ODD——對照溶液D 吸光度。

2.5 色度測定

采用模擬加速試驗(yàn)，使用鮮切香蕉，產(chǎn)品實(shí)際應(yīng)用時為帶果皮使用。選取同一批次大小均一、無病蟲害的新鮮香蕉，觀察不同藥物及濃度對果實(shí)外觀的影響，香蕉切成6 mm 厚片，每個樣品做6 個平行組，分別用不同質(zhì)量濃度（0.5 g/L 和1.0 g/L）的SA 水溶液、（0.5 g/L 和1.0 g/L）SAM水溶液、1.0 g/L β-環(huán)糊精（β-CD）浸泡5 min，以水（CK）浸泡作為對照，撈出后自然晾干，置于室溫（25±2 ℃）貯藏。根據(jù)文獻(xiàn)[22]，運(yùn)用色差儀測其L*值（即亮度）的變化，以此比較褐變的程度及使用效果。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0（2018）軟件繪圖，統(tǒng)計(jì)方法使用Spss（22.0）軟件，采用數(shù)據(jù)=平均值±SE（n=3）。

3 結(jié)果與分析

3.1 微膠囊中SA 含量及包埋率

根據(jù)2.2 方法對SAM中所包埋的SA 含量進(jìn)行測定。根據(jù)SA 質(zhì)量濃度和峰面積對應(yīng)關(guān)系得到的回歸方程為Y=7 427X+514.07（R2=0.996 8），SA 在10～2 500 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

SA 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見圖1，SAM 液相色譜圖見圖2。

圖1 SA 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖2 SAM 液相色譜圖

檢測掃描得到SA 最大吸收波長為300 nm，選擇在此波長下的色譜峰面積定量，在該色譜條件下SA 的保留值為5.3 min。將SAM 樣品配成質(zhì)量濃度為3 mg/mL 的溶液進(jìn)行液相測試，帶入回歸方程計(jì)算結(jié)果SAM 樣品中含有0.75 mg/mL 的SA，由此計(jì)算得到SAM的包埋率為25.0%。

3.2 SA 及SAM對酪氨酸酶活性的抑制作用

酪氨酸酶普遍存在于生物體中，是多功能銅結(jié)合氧化酶，可以作為酪氨酸羥化酶、多巴氧化酶，是產(chǎn)生黑色素的決定性酶，也是引起蔬果褐變的關(guān)鍵酶[23]。酪氨酸酶具有雙重催化作用，首先羥化酪氨酸生成多巴，多巴進(jìn)一步氧化得多巴醌和多巴色素，進(jìn)而形成一系列引起褐化的色素類物質(zhì)[24-25]。在連鎖氧化反應(yīng)過程中抑制酪氨酸酶活性并使其失活，即可有效制止氧化反應(yīng)的發(fā)生，延緩果實(shí)發(fā)生褐變。通過研究SA 和SAM 對酪氨酸酶的抑制率，可以考查兩者防止褐變的效果。

SA 及SAM溶液對酪氨酸酶的抑制作用與濃度的關(guān)系見圖3。

圖3 SA 及SAM 溶液對酪氨酸酶的抑制作用與濃度的關(guān)系

溶液濃度指SA 濃度或SAM包埋的SA 在溶液中的實(shí)際濃度。由圖3 可知，SA 及SAM對酪氨酸酶的影響存在較明顯的量效作用，SAM 中的SA 濃度為250 nmol/L 時，顯示對酪氨酸酶抑制效果最強(qiáng)，抑制率最高達(dá)到69%，顯著大于同一濃度下SA 對酪氨酸酶的抑制率43%（p＜0.05)。如果采用抑制率達(dá)到50%的濃度（IC50）作為評價抑制能力強(qiáng)弱的指標(biāo)，在試驗(yàn)中顯示出SAM 的IC50為31.2 nmol/L，而SA的IC50為125 nmol/L，SAM的抑制能力比SA 提高了4 倍。結(jié)果表明，SA 經(jīng)過微膠囊化后，其對酪氨酸酶作用的敏感度提高了，在一定程度上，較少的SA用量對酪氨酸酶就能起到同樣的抑制作用，不僅減小SA 帶來的刺激性味道，而且還提高了SA 的利用度。在測試的濃度范圍內(nèi)，SA 對酪氨酸酶的抑制率隨SA 濃度的增大而逐漸增大，于250 nmol/L 達(dá)到抑制的最高值，隨后隨著SA 濃度的增大，抑制率逐漸減小，可能是由于酪氨酸酶反應(yīng)完全或SA 濃度已達(dá)到了作用的飽和狀態(tài)，導(dǎo)致抑制率的下降。

SA 及SAM 對酪氨酸酶的抑制作用隨時間變化的曲線（CSA 為31.2 nmol/L）見圖4。

圖4 SA 及SAM 對酪氨酸酶的抑制作用隨時間變化的曲線（CSA 為31.2 nmol/L）

圖4 為在31.2 nmol/L 濃度下SAM 和SA 溶液對酪氨酸酶的作用隨時間變化的曲線，圖4 中0 點(diǎn)為加入樣品試劑后開始讀數(shù)的記錄點(diǎn)，SAM與SA 對酪氨酸酶抑制率隨時間的增加而減少，在反應(yīng)的前30 min里下降幅度較快，抑制率減少至10%，說明SAM和SA 與酪氨酸酶反應(yīng)在約30 min 短時間內(nèi)反應(yīng)速率最大，然而試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示SAM對酪氨酸酶的抑制率始終高于SA，反映出SAM對酪氨酸酶的抑制能力顯著高于SA。以β -環(huán)糊精為壁材包合SA 制備成微膠囊后提高了藥物的溶解性和穩(wěn)定性，防止藥物氧化與分解，使其充分地發(fā)揮其抑制酶活性的作用，從而使其抑制酶活性的能力更高。β -環(huán)狀糊精是食品級原料，常用于食品制造，在此作為微膠囊主要壁材包埋SA，還達(dá)到消除異味的效果，解決了SA 的刺激性大的問題[26]。

3.3 SAM與SA 對色澤變化的影響

酪氨酸酶在細(xì)菌和植物體內(nèi)均為可溶性的，在植物體內(nèi)形成黑色素的唯一途徑是通過酪氨酸酶控制L-多巴轉(zhuǎn)化為L-多巴醌，多巴醌再經(jīng)過一系列的反應(yīng)最終形成黑色素[27]。因此，可以以色澤變化評價樣品對酪氨酸酶的影響。使用色差儀測試用SAM和SA 浸泡后的香蕉色度，于室溫（25±2 ℃）在0 h 及放置24，48 h 時測定香蕉的色度。

貯藏過程中香蕉色度隨時間的變化見圖5。

圖5 貯藏過程中香蕉色度隨時間的變化

色澤是食品質(zhì)量的一個重要特性，L*表示亮度，亮度減小，褐變加重。香蕉的果實(shí)容易因?yàn)槊复俸肿兎磻?yīng)而導(dǎo)致香蕉的褐變及腐爛[28-29]。PPO 活性升高引發(fā)酶促褐變反應(yīng)，表現(xiàn)果皮變色，造成營養(yǎng)丟失及經(jīng)濟(jì)損失[30]。由圖5 可知，在貯藏期用不同濃度的不同樣品組浸泡香蕉，每組初始浸泡時的亮度值無區(qū)別，浸泡后保存24 h 測試，所有組別溶液的亮度值與0 h 相比有明顯下降，下降值約為15%，24 h時香蕉已發(fā)生褐變，浸泡24 h 后只有1.0 g/L SAM組保持高的亮度值，說明香蕉褐變較小。結(jié)果表明除了SAM高劑量組以外的所有組別溶液均未顯示出有效抑制酶促褐變的作用。Orang K 等人[31]研究在5 ℃冷藏條件下用SA 溶液處理香蕉能夠明顯抑制多酚氧化酶活性來減緩果實(shí)發(fā)生褐變。試驗(yàn)中浸泡后于常溫保存48 h 后，除1.0 g/L SAM 組以外的其他組亮度值都顯著降低，結(jié)果表明經(jīng)1.0 g/L SAM組作用的亮度值雖然隨時間增長而減小，但該組的亮度值下降最低，24 h 和48 h 該組的亮度值明顯高于SA組、低劑量SAM組及壁材組等其他對照組，48 h 時其亮度值為55%，高于其他組至10%～15%，表明1.0g/L 的SAM溶液能夠有效抑制褐變發(fā)生。

SA 的低溶解性可能是其抑制褐變效果不明顯的一個主要原因，通過微膠囊化使SA 在水溶液中分散性增強(qiáng)，增大SA 與物體表面的實(shí)際接觸面積，同時通過緩慢釋放抑制酶活性。推測是微膠囊化后的SAM 在溶液中均勻分散，在果實(shí)表面形成一層保護(hù)膜，隔離空氣的接觸，防止發(fā)生氧化反應(yīng)，減小褐變發(fā)生。低濃度的SAM不能有效抑制酪氨酸酶活性的原因可能是果實(shí)中存在一些酚類物質(zhì)與SA 形成氫鍵作用，從而影響SA 與酪氨酸酶活性位點(diǎn)的結(jié)合，隨著SA 濃度的增加，SA 抑制酶活性逐漸占主導(dǎo)地位就能夠有效地抑制褐變[32]。酸化作用、與酶的結(jié)合作用是SA 抑制多酚氧化酶和控制酶促褐變的主要作用機(jī)制，SA 對PPO 是競爭性抑制作用，酸性pH 值增強(qiáng)了SA 與PPO 的結(jié)合，降低了結(jié)合能，增加了氫鍵和靜電相互作用[33]。低濃度的SAM 沒有提供足夠的酸性條件，與PPO 的結(jié)合能力低，可能與其未顯示出抑制褐變的作用相關(guān)。將SA 微膠囊化后顯示出有效延緩酶促反應(yīng)速率的結(jié)果，SAM 抑制褐變作用呈劑量依賴性，進(jìn)一步增加微膠囊中SA 的濃度可能會更好地發(fā)揮其抑制褐變作用。SAM 能夠顯著提高SA 在溶液中的分散性和穩(wěn)定性使其抑制褐變效果更好，使果蔬保鮮更持久。

4 結(jié)論

探討了SA、SAM對酪氨酸酶的抑制效果，并以其對香蕉的褐變抑制效應(yīng)作為輔助驗(yàn)證。結(jié)果表明，SAM溶液在31.2 nmol/L 濃度下能夠有效抑制酪氨酸酶活性和抑制酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生，其效果顯著高于SA 溶液。試驗(yàn)中，SAM 溶液在31.2 nmol/L 濃度能夠有效抑制酪氨酸酶活性，并于250 nmol/L 達(dá)到抑制的最大值，使用1.0 g/L SAM可在常溫條件下就能夠有效抑制香蕉發(fā)生褐變。一個驗(yàn)證基礎(chǔ)理論的初步試驗(yàn)，應(yīng)用到果蔬全儲運(yùn)期的保鮮需要今后進(jìn)一步的研究?？傊琒AM 溶液對易因酪氨酸酶引起作用是抑制效果良好的，且制備SAM 成本低，在果蔬貯藏保鮮中有潛在的應(yīng)用價值，SAM 將可能是具有市場潛力的酪氨酸酶抑制劑和食品保鮮劑。