蜱傳腦炎病毒E蛋白D Ⅲ的表達與抗體間接ELISA檢測方法的建立

張夢瑤，焦翠翠，黃 培，金宏麗，白玉潔，龔志遠，宋雨濛，李媛媛，張海麗，王化磊

(吉林大學動物醫(yī)學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062)

蜱傳腦炎(tick-borne encephalitis，TBE)又稱森林腦炎，是由蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBEV)引起的一種以中樞系統(tǒng)疾病為主的人獸共患傳染病，臨床上表現(xiàn)為腦膜炎、腦炎伴或不伴脊髓炎，可導致死亡或長期的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[1-2]，嚴重危害人類健康和公共衛(wèi)生安全。TBE主要在歐、亞地區(qū)流行，俄羅斯每年報告的人類感染病例1萬～1.5萬，歐洲每年報告的病例超過1.25萬例[3]。大多數(shù)蜱傳腦炎病例發(fā)生于生活或工作在森林中的人員，在中歐和東歐的許多山林地區(qū)，TBE發(fā)病率遠高于所有其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的總和[4]。TBEV在自然界循環(huán)于蜱和野生動物之間，蜱是主要的傳播媒介，此外，TBEV還可通過食用來自受感染牲畜的未經(jīng)巴氏滅菌的奶制品傳染給人和動物[5]。由于感染季節(jié)的延長和流行地區(qū)的擴大，TBE的發(fā)病率正在逐年增加[6]。1943年我國發(fā)現(xiàn)首例人類感染病例，1952年首次分離到TBEV[7]。近年來，我國TBEV的感染人數(shù)顯著增加，一些以前未受感染的地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了TBEV的存在，如云南、新疆、青海和西藏等[8-11]。目前，尚沒有針對TBE的特效藥物，臨床治療仍以緩解癥狀為主[12-13]。

TBEV E蛋白為包膜蛋白，是一個Ⅱ級融合蛋白，在病毒粒子的組裝、出芽、病毒囊膜和宿主細胞膜融合過程中發(fā)揮著關鍵作用。E蛋白由3個結構域(DomainsⅠ,Ⅱ,Ⅲ)、1個莖區(qū)和1段跨膜域構成，莖區(qū)和疏水的錨定區(qū)形成E蛋白碳端第4個結構域(Domains Ⅳ)。Domain Ⅲ由約100個氨基酸殘基構成，位于病毒顆粒表面，折疊形成一個IgG樣結構，包含了E蛋白最重要的中和抗體表位，該結構能有效阻止E蛋白在pH誘導下產(chǎn)生構象變化，使E蛋白無法與抗體結合[14-15]。因此，E蛋白Domain Ⅲ是TBEV檢測、免疫預防和藥物研發(fā)的主要靶點。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株原核表達載體pET-30a(+)、TBEV E基因重組質粒、Stellar和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞等均由吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室病毒病研究室構建和保存。

1.2 主要試劑2×PhantaMaxMaster Mix(含DNA聚合酶)購自南京諾唯贊生物科技有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶、BCA蛋白濃度測定試劑盒、小鼠抗His單克隆抗體均購自美國Thermo公司，Ni-NTA Agarose純化柱購自德國QIAGEN公司。HRP 標記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG為美國Bio-world 公司產(chǎn)品。TMB顯色液、卡那霉素均購自北京索萊寶科技有限公司。TBEV陽性兔血清系利用昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的TBEV-prME蛋白免疫健康家兔所得；TBEV、JEV、ZIKV和WNV陽性鼠血清由純化的病毒樣顆粒免疫健康小鼠制備；TBEV病毒樣顆粒(TBEV VLPs)由本實驗室利用昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)制備。

1.3 引物的設計與合成根據(jù)GenBank中公布的TBEV基因序列，選擇遠東亞型毒株WH2012(GenBank：KJ755186)，合成E蛋白基因序列。根據(jù)E蛋白Domain Ⅲ基因序列，分別設計上游引物TBEV-E-D Ⅲ-F：5′-TAAGAAGGAGATATATACA-TATGAAAGGCCTGACCTACACCATG-T-3′(下劃線部分為NdeⅠ 酶切位點)和下游引物TBEV-E-D Ⅲ-R:5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTC-GAGTTTCTGGAACCACTGGTGGC-3′(下劃線部分為XhoⅠ 酶切位點)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 目的基因擴增以合成質粒TBEV-E為模板，TBEV-E-D Ⅲ-F和TBEV-E-D Ⅲ-R為引物，通過PCR擴增TBEV E Domain Ⅲ基因。反應體系為：2×PhantaMaxMaster Mix 25 μL，模板0.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ddH2O 22.5 μL。擴增條件為：95℃ 3 min；95℃ 15 s，65℃ 15 s，72℃ 20 s，5個循環(huán)；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，回收目的基因條帶。

1.5 重組質粒的構建及鑒定將原核表達載體pET-30a(+)經(jīng)NdeⅠ 和XhoⅠ 雙酶切，回收pET-30a(+)載體片段。將回收的pET-30a(+)載體片段與膠回收的TBEV E Domain Ⅲ基因PCR產(chǎn)物按一定比例混合，50℃連接20 min。連接產(chǎn)物轉化至Stellar感受態(tài)細胞，挑取單克隆，經(jīng)雙酶切鑒定正確后進行序列測定分析。將鑒定正確的重組質粒命名為pET-30a(+)-TBEV-E-D Ⅲ，并將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)構建重組表達菌株。

1.6 目的蛋白Western blot檢測將構建的重組表達菌株和pET-30a(+)空載體菌株分別接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)至D600 nm處于0.6～0.8時，加入0.4 mmol/L IPTG，37℃誘導表達5 h，對未誘導的pET-30a(+)空載體、誘導的pET-30a(+)空載體、未誘導的重組菌和誘導的重組菌進行Western blot鑒定，確定目的蛋白是否成功表達。

1.7 重組菌株最佳表達條件與目的蛋白表達形式的確定將構建的重組表達菌株接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)至D600 nm處于0.6～0.8時，分別進行溫度、IPTG濃度、時間等表達條件的優(yōu)化[16]。將不同表達條件下收獲的樣品進行SDS-PAGE分析，確定重組菌株最佳表達條件。將最佳表達條件下培養(yǎng)的菌液4℃、12 000 r/min離心2 min，用溶菌酶重懸沉淀，室溫下裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心2 min，取出上清，用PBS重懸沉淀，將菌體上清、裂解上清和裂解后沉淀進行SDS-PAGE分析，確定重組蛋白的表達形式。

1.7.1溫度 加入0.4 mmol/L的誘導劑IPTG，分別在16,25,30,37℃條件下誘導表達5 h。

1.7.2IPTG 加入不同濃度的IPTG(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5,2.0 mmol/L)，在37℃條件下誘導表達5 h。

1.7.3時間 加入0.4 mmol/L的IPTG，37℃條件下,分別誘導0,1,2,3,4,5,6,7,8 h。

1.8 目的蛋白的純化在最佳表達條件下進行重組菌的大量增殖，4℃、8 000 r/min離心15 min收獲菌體沉淀，超聲破碎直至溶液澄清(冰上120 W超聲破碎30 min)。將裂解的溶液經(jīng)4℃、12 000 r/min離心15 min收集上清液，與His-Ni柱填料4℃結合過夜，按試劑盒說明書進行目的蛋白的純化。純化后的蛋白以SDS-PAGE進行鑒定，并用BCA方法測定蛋白濃度，分裝后―80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 TBEV抗體間接ELISA檢測方法的建立參考文獻[17]，按照棋盤滴定法分別探索重組蛋白包被質量濃度(0.1，0.5，1.0,5.0,10.0 mg/L)、待檢血清最佳反應時間(0.5,1.0,1.5,2.0 h)、酶標二抗工作濃度(1∶5 000,1∶10 000,1∶20 000,1∶40 000)和孵育時間(0.5,1.0,1.5,2.0 h)等條件。用酶標儀測定D450 nm值，并計算P/N(檢測值/陰性對照值)。P/N值≥2.1為陽性，比值最大時為最佳ELISA反應條件。

1.10 特異性與敏感性試驗用建立的TBEV抗體間接ELISA方法分別檢測TBEV、JEV、ZIKV和WNV陽性血清，評價該檢測方法的特異性。將TBEV陽性兔血清分別按1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶16 800比例稀釋后進行檢測，評價該方法的敏感性。

1.11 重復性試驗將同一批次純化的重組蛋白TBEV E-D Ⅲ分別包被酶標板，建立TBEV抗體間接ELISA檢測方法(3次)，對不同的TBEV陽性血清(利用昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的TBEV-prME蛋白免疫健康家兔，第4,5,6次免疫后采取的血清)進行檢測，每份樣品重復4孔，判定批內(nèi)重復性；分別以3個批次純化的重組蛋白TBEV E-D Ⅲ包被酶標板，用建立的TBEV抗體間接ELISA檢測方法對不同的TBEV陽性血清進行檢測，判定批間重復性。

1.12 TBEV抗體間接ELISA檢測方法的初步應用將純化的TBEV VLPs按20 μg/只免疫小鼠(n=7)，每3周進行1次加強免疫，三免后4周采集小鼠血清，以建立的TBEV抗體間接ELISA檢測方法對小鼠血清進行TBEV抗體效價檢測。

2 結果

2.1 重組質粒的構建與鑒定將PCR擴增后的TBEV E-D Ⅲ基因產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結果顯示在321 bp處出現(xiàn)預期大小的條帶，與TBEV E-D Ⅲ基因片段大小相符(圖1A)。將擴增產(chǎn)物和雙酶切后的pET-30a(+)載體片段進行連接，并將連接產(chǎn)物轉化至Stellar感受態(tài)細胞。挑取單菌落提取重組質粒后經(jīng)SmaⅠ、KpnⅠ雙酶切進行鑒定(圖1B)，鑒定正確的重組質粒進行序列測定分析，結果顯示其序列與合成的TBEV E-D Ⅲ基因序列同源性為100%，表明成功構建了含TBEV E-D Ⅲ基因的重組質粒，將其命名為pET-30a(+)-TBEV-E-D Ⅲ。

2.2 目的蛋白的表達將重組質粒pET-30a(+)-TBEV-E-D Ⅲ與空載體質粒分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，用IPTG進行目的蛋白的誘導表達。Western blot鑒定表達產(chǎn)物，結果顯示在12 kDa處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預期蛋白大小一致，表明重組菌經(jīng)IPTG誘導后可成功表達目的蛋白(圖2)。

A.TBEV-E-D Ⅲ基因的PCR 擴增;B.重組質粒pET30a(+)-TBEV-E-D Ⅲ的鑒定。M1.DL2000 DNA Marker;1.TBEV-E-D Ⅲ基因的PCR擴增；M2.DL5000 DNA Marker;2.重組質粒的雙酶切鑒定產(chǎn)物

M.蛋白Marker;1.IPTG誘導空載體;2.IPTG誘導重組菌;3.未誘導重組菌;4.未誘導空載體

2.3 目的蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化將重組菌株分別在不同溫度(16,25,30,37℃)、不同濃度的IPTG(0～2 mmol/L)，誘導不同時間(0～8 h)后，取樣進行SDS-PAGE分析(圖3,4,5)。本著“節(jié)約成本”原則，30℃、0.6 mmol/LIPTG誘導6 h為最佳蛋白誘導表達條件。

M.蛋白Marker;1～4.37,30,25,16℃誘導表達的重組菌

M.蛋白Marker;1～9.IPTG誘導0～8 h的重組菌

M.蛋白Marker;1～9.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,2.0 mmol/L IPTG誘導的重組菌

2.4 目的蛋白表達形式的鑒定將最佳表達條件下培養(yǎng)的菌液，經(jīng)溶菌酶裂解，分別取菌液上清、裂解液上清、裂解后沉淀進行SDS-PAGE分析(圖6)，結果顯示，目的蛋白主要以包涵體形式表達。

M.蛋白Marker;1.誘導后的重組菌裂解上清;2.誘導后的重組菌上清;3.誘導后的重組菌裂解沉淀

2.5 目的蛋白的純化將誘導表達的重組蛋白以鎳離子親和層析柱進行純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析(圖7)，結果顯示在12 kDa處出現(xiàn)單一的目的條帶。

2.6 TBEV抗體間接ELISA檢測方法的建立按照棋盤法進行TBEV抗體間接ELISA檢測方法條件的優(yōu)化，結果如表1,2,3所示，結合設定的優(yōu)選原則：P/N值≥2.1為陽性，P/N比值最高。最終確定抗原的包被質量濃度為1 mg/L；一抗的孵育時間為0.5 h；酶標二抗的稀釋度為1∶40 000，37℃孵育0.5 h。

M.蛋白Marker;1.純化后的重組蛋白TBEV E-D Ⅲ

表1 TBEV E-DⅢ蛋白包被量與血清稀釋度

表2 一抗孵育時間

2.7 TBEV抗體間接ELISA檢測方法的特異性和敏感性評價分別利用TBEV、JEV、WNV、ZIKV陽性血清評價所建立TBEV抗體間接ELISA檢測方法的特異性(圖8A)，結果顯示僅TBEV陽性血清的P/N值高于2.1為陽性，而JEV、WNV和ZIKV陽性血清檢測的P/N值均低于2.1為陰性，表明該檢測方法具有良好的特異性。將TBEV 陽性血清按1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶12 800進行稀釋后，以建立的ELISA檢測方法進行檢測(圖8B)。結果顯示，當將TBEV陽性血清進行1∶12 800稀釋時，檢測結果仍為陽性(P/N= 2.24，大于2.1)，表明該方法有良好的敏感性。

表3 酶標二抗稀釋度和孵育時間

A.特異性檢測；B.敏感性檢測

2.8 重復性試驗用同一批次純化的重組蛋白TBEV E-D Ⅲ分別建立TBEV抗體間接ELISA檢測方法，判定批內(nèi)重復性；分別用3個批次純化的重組蛋白TBEV E-D Ⅲ作為包被抗原建立檢測方法，判定批間重復性。結果顯示，3份TBEV陽性血清樣本批內(nèi)重復檢測和批間重復檢測的D450 nm值變異系數(shù)均低于10%，表明該ELISA方法具有良好的重復性(表4)。

表4 TBEV抗體間接ELISA檢測方法重復性試驗檢測結果

2.9 TBEV抗體間接ELISA檢測方法的初步應用

將TBEV VLPs免疫小鼠血清進行2倍梯度稀釋，應用建立的TBEV抗體間接ELISA檢測方法測定血清TBEV IgG抗體水平。結果顯示，TBEV VLPs免疫后小鼠血清中TBEV IgG平均抗體效價可達1∶40 960(n=7)(圖9)，表明該檢測方法可用于血清TBEV IgG抗體水平檢測。

3 討論

近年來，TBEV在全球的流行趨勢上升，疫源地不斷擴大，且臨床上仍沒有特效救治藥物[12-13,18-19]，因此快速診斷和免疫預防顯得尤為重要。根據(jù)基因型的不同TBEV可分為3種亞型：歐洲亞型、西伯利亞亞型和遠東亞型，每一種亞型都可導致不同嚴重程度的臨床疾病[8-9]。其中，遠東亞型流行于俄羅斯、中國等地區(qū)，且毒力最強，病死率高達5%～20%，極易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[20]。人和動物感染TBEV后，病毒血癥存在的時間很短，PCR檢測方法并不適用，血清學檢測成為蜱傳腦炎診斷的主要方法。目前，國外的TBEV檢測方法多針對歐洲亞型和西伯利亞亞型[21]，國內(nèi)建立的針對遠東亞型毒株的血清學檢測方法多選用經(jīng)典毒株“森張”株[22-23]，該毒株于20世紀50年代分離，近年來在我國分離的TBEV流行毒株已與其有較大變異。本試驗以2012年于我國分離的遠東亞型毒株WH2012[24](GenBank：KJ755186)為對象，表達并純化了E-D Ⅲ蛋白，同時建立了TBEV抗體間接ELISA檢測方法，為我國蜱傳腦炎的快速診斷和流行病學調(diào)查提供了技術手段。

圖9 TBEV抗體間接ELISA檢測方法在血清TBEV IgG抗體水平檢測中的應用

TBEV E蛋白作為包膜蛋白被廣泛應用于蜱傳腦炎的診斷和亞單位疫苗的研發(fā)，但由于黃病毒屬病毒之間存在較強的抗體交叉反應，因此針對完整E蛋白的抗體檢測方法容易出現(xiàn)假陽性。噬斑減少中和試驗(PRNT)可以有效減少黃病毒間交叉反應引起的假陽性，但必須在生物安全3級(BSL-3)以上的實驗室進行，極大的限制了臨床檢測的數(shù)量和效率[21]。E-D Ⅲ位于病毒粒子表面含有E蛋白的主要抗原表位，可誘導機體產(chǎn)生特異性中和抗體。HARRISON等[25]研究表明，黃病毒交叉反應性抗體大多是由E蛋白的DomainⅠ/Domain Ⅱ誘導產(chǎn)生。因此，E-D Ⅲ成為目前黃病毒疫苗開發(fā)和血清學檢測的主要靶標。王丹等[22]建立了針對TBEV E-D Ⅲ的抗體間接ELISA方法，發(fā)現(xiàn)該方法可與TBEV患者陽性血清發(fā)生反應，證明TBEV E-D Ⅲ可作為TBEV特異性血清學檢測的候選抗原。RIZZO等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TBEV患者陽性血清既能識別原核表達的TBEV E蛋白，也能識別E-D Ⅲ蛋白，但E-D Ⅲ重組蛋白具有更高的特異性，且不與WNV陽性血清發(fā)生交叉反應，表明E-D Ⅲ能更好地識別黃病毒的特異性抗體。本試驗利用純化的TBEV E-D Ⅲ重組蛋白作為包被抗原建立的TBEV抗體間接ELISA檢測方法，與JEV、WNV、ZIKV等黃病毒屬病毒陽性血清均無交叉反應，進一步驗證了TBEV E-D Ⅲ可作為蜱傳腦炎血清學診斷的靶抗原。

大腸桿菌表達系統(tǒng)無法進行糖基化修飾，但成本低、易于培養(yǎng)、可高水平表達重組蛋白[16,22]。TBEV E蛋白唯一的糖基化位點(Asn154)位于Domain Ⅱ[14]，YOSHII等[27]研究發(fā)現(xiàn)E蛋白糖基化缺失的TBEV能有效的誘導小鼠產(chǎn)生抗TBEV中和抗體，表明TBEV E蛋白糖基化的缺失不會影響抗原檢測。ELISA方法具有靈敏、快速、簡便和易于標準化等優(yōu)點，且適合高通量檢測，臨床上以ELISA方法對血液樣本進行抗體檢測，可顯著提高檢測效率。在選擇包被抗原時，重組蛋白比從病毒感染細胞中提取的抗原更加安全有效，且重組蛋白的來源簡單，易于規(guī)?；a(chǎn)[28]。本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達重組蛋白TBEV E-D Ⅲ，并以不同批次純化的重組蛋白作為包被抗原，檢測了不同的TBEV陽性血清，結果顯示，TBEV抗體間接ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復性，可用于TBEV抗體的檢測。