毛裂蜂斗菜中的1個新的倍半萜化合物

李炳，張 勇 ，賈 琦*，李醫(yī)明，朱維良

1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203

2.中國科學院新疆理化技術研究所，中國科學院干旱區(qū)植物資源化學重點實驗室，省部共建新疆特有藥用資源利用國家重點實驗室培育基地，新疆 烏魯木齊 830011

3.中國科學院上海藥物研究所，新藥研究國家重點實驗室，中科院受體結(jié)構(gòu)與功能重點實驗室，上海 201203

4.中國科學院大學，北京 100049

毛裂蜂斗菜Petasites tricholobusFranch.是菊科（Compositae）千里光族（Senecioneae Cass.）蜂斗菜屬PetasitesMill.的多年生草本植物[1]。蜂斗菜屬植物全球共有18種，分布于歐洲、亞洲、北美洲，我國有6個品種，分別是蜂斗菜P.japonicus(Seib.et Zucc.) Maxim、掌葉蜂斗菜P.tatewakianusKitam.、鹽源蜂斗菜P.versipilisHand.Mazz、臺灣蜂斗菜P.formasanusKitam.、長白蜂斗菜P.rubellus(J.F.Gmel.) Toman和毛裂蜂斗菜P.tricholobusFanch.，其廣泛分布于東北、華東和西南部[2]。毛裂蜂斗菜具有清熱解毒、散瘀消腫功效，民間常用于治療扁桃體炎、毒蛇咬傷、解毒去痰等病癥[3]?，F(xiàn)代研究表明，毛裂蜂斗菜具有豐富的藥理活性，如神經(jīng)保護、抗氧化、抗過敏、抗腦缺血、抗炎等[4-8]。本課題組前期對毛裂蜂斗菜95%乙醇提取物中化學成分進行了系統(tǒng)的研究，從中分離得到多個酚類化合物[9]和2個特征性的倍半萜硫酸酯類化合物[10]。近期，本課題組從該植物50%乙醇提取物中分離得到5個倍半萜類化學成分（圖1），其中化合物1為新化合物，命名為毛裂蜂斗菜素（petatricholide），其余4個化合物均為倍半萜螺內(nèi)酯類化合物，分別為bakkenolide IIIb（2）、monoketone（3）、japonipene C（4）和petatewalide A（5），化合物2～5均為首次從毛裂蜂斗菜中分離得到。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound 1

1 儀器與材料

ESI-MS由Agilent G6520 Q-TOF LC-MS型質(zhì)譜儀測定；EI-MS由Thermo DFS型質(zhì)譜儀測定；旋光用Autopol VI 90079型旋光儀測定；紅外光譜用Thermo nicolet 6700型紅外光譜儀測定；1H、13C和2D NMR用Bruker Avance III 500型核磁共振儀測定，ROESY用Varian vnmrs 400型核磁共振儀測定，以TMS為內(nèi)標。300～400目硅膠、H硅膠（國藥集團化學試劑有限公司）；ODS-A-HG 12 nm S-50 μm（日本YMC公司）；Sephadex LH-20型凝膠（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司）；微孔樹脂（MCI GEL CHP20P，日本三菱化學株式會社）；硅膠GF254預制薄層色譜板（煙臺化學工業(yè)研究所），顯色劑（硫酸-香蘭素顯色劑）；所用試劑甲醇、乙醇、醋酸乙酯、正丁醇、石油醚、環(huán)己烷、二氯甲烷等試劑均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。

本實驗藥材毛裂蜂斗菜全草于2009年10月采自重慶，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學中藥研究所吳立宏研究員鑒定為菊科蜂斗菜屬植物毛裂蜂斗菜P.tricholobusFanch.，標本（FDC-20091029）保存于上海中醫(yī)藥大學中藥學院中藥化學教研室。

2 提取與分離

干燥的毛裂蜂斗菜全草（6.5 kg），粉碎后采用95% 乙醇加熱回流提取3次，藥渣采用50%乙醇100 ℃回流提取2次，收集2次濾液濃縮得到50%乙醇提取濃縮液。50%乙醇提取液依次采用醋酸乙酯和正丁醇等體積多次萃取，依次得到醋酸乙酯和正丁醇萃取液，減壓濃縮后分別獲得醋酸乙酯萃取物（21 g）、正丁醇萃取物（153 g）和萃取后水層3個部位。隨后采用薄層色譜（TLC）方法對醋酸乙酯和正丁醇萃取物中主要特征性成分進行初步分析，根據(jù)倍半萜類化合物在顯色劑（硫酸-香蘭素顯色劑）下的顯色特征，優(yōu)選醋酸乙酯萃取物進行后續(xù)的分離純化。

醋酸乙酯萃取部位（21 g）采用300～400目硅膠，以二氯甲烷-甲醇體系梯度洗脫（15∶1、9∶1、6∶1、4∶1、1∶1），得到4個組分（Fr.1～4）。Fr.1（5.3 g）經(jīng)H硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯體系進行梯度洗脫（40∶1、20∶1、9∶1、6∶1、4∶1、2∶1），得到4個組分（Fr.1.1～1.4）。Fr.1.1（1.6 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜進行純化，二氯甲烷-甲醇等度洗脫（1∶1），得到Fr.1.1.1（960 mg）。Fr.1.1.1經(jīng)ODS柱色譜，甲醇-水（0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、75∶25）梯度洗脫，得到化合物1（2.5 mg）、4（24.9 mg）、5（7.1 mg）。Fr.1.3（812 mg）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜二氯甲烷-甲醇等度洗脫（1∶1），洗脫后主成分采用ODS柱色譜二次純化，甲醇-水梯度洗脫（0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20）后得到化合物2（16.7 mg）。Fr.2（2.1 g）經(jīng)300～400目硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（30∶1、15∶1、10∶1、6∶1、4∶1、1∶1）梯度洗脫，得到3個組分（Fr.2.1～2.3）。Fr.2.2（163 mg）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇等度洗脫（1∶1），洗脫后主成分采用MCI柱色譜，甲醇-水梯度洗脫（0∶100、20∶80、40∶60、50∶50、70∶30）分離純化，得到化合物3（2.9 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)化合物1的HR-ESI-MSm/z471.181 1 [M+Na]+（計算值471.181 7，C24H32O6SNa），確定該化合物的分子式為C24H32O6S，相對分子質(zhì)量為448，不飽和度為9。IR光譜中1732 cm?1和 1647 cm?1處的特征吸收峰表明其結(jié)構(gòu)中含有α,β-不飽和酯。1H-NMR數(shù)據(jù)顯示（表1），高場區(qū)有6個甲基信號δH2.41 (3H, s), 1.98 (3H, m), 1.89 (3H, t,J= 1.5 Hz),1.71 (3H, brs), 1.66 (3H, brs) 和1.42 (3H, s)；δH7.35(1H, d,J= 10.2 Hz), 5.76 (1H, d,J= 10.2 Hz) 信號提示結(jié)構(gòu)中含有1組順式不飽和烯氫質(zhì)子。13C-NMR數(shù)據(jù)（表1）顯示該化合物含有24個碳信號，結(jié)合DEPT135圖譜信息顯示δC24.6, 19.4, 17.6,16.7, 14.7, 13.7為6個甲基信號，δC112.6, 31.9和31.3為3個亞甲基信號，δC154.4, 138.3, 119.1, 110.7,75.2, 74.5, 64.3, 44.0為8個次甲基信號，δC201.7,166.9, 165.3, 147.9, 134.1, 127.8, 61.3為7個季碳信號。δC201.7信號提示結(jié)構(gòu)中含有1個酮式結(jié)構(gòu)，δC166.9和165.3顯示結(jié)構(gòu)中含有2個酯鍵，δC154.4,147.9, 138.3, 134.1, 127.8, 119.1, 112.6, 110.7則顯示結(jié)構(gòu)中含有8個不飽和碳信號。上述特征信號與化合 物 1α-(3′-ethyl-cis-crotonoyloxy)-8-angeloyloxy-3β,4β-epoxy-bisabola-7(14),10-diene[11]類似，主要差異在于化合物1的C-1位取代基是甲基硫代丙烯酰氧基（methylthioacryloyloxy），而已報到化合物C-1位是乙酰基取代?；衔?的平面結(jié)構(gòu)通過HSQC與HMBC譜做進一步的確定，在HMBC譜（圖2）中H-1 (δH5.72, 1H) 和C-1′ (δC165.3) 相關，顯示甲基硫代丙烯酰氧基與C-1相連；H-8 (δH5.21, 1H)和 C-1′′(δC166.9) 相關，顯示當歸酰氧基(angeloyloxy) 與C-8相連；H-14 (δH5.27, 1H;δH5.16, 1H) 和C-7 (δC147.9), C-8 (δC75.2), C-6 (δC44.0) 相關，H-8 (δH5.21, 1H) 和C-7 (δC147.9) 相關，H-6 (δH2.94, 1H) 和C-7 (δC147.9), C-14 (δC112.6) 相關，上述信號顯示C-7位是連接C-14、C-8和C-6位的關鍵位點；H-12 (δH1.71, 3H) 和C-11 (δC134.1), C-10 (δC119.1) 相關，H-13 (δH1.66, 3H) 和C-11 (δC134.1) 相關，上述信號顯示12和13位甲基與C-11相連；H-15 (δH1.42, 3H) 和C-3 (δC61.3),C-4 (δC64.3), C-2 (δC201.7) 相關，顯示15位甲基與C-3相連；H-4′ (δH2.41, 3H) 和C-3′ (δC154.4) 相關，顯示4′位甲基與C-3′相連；H-4′′ (δH1.98, 3H) 和C-3′′ (δC138.3), C-2′′ (δC127.8) 相關，H-5′′ (δH1.89,3H) 和C-1′′ (δC166.9), C-2′′ (δC127.8), C-3′′ (δC138.3) 相關，上述信號顯示4′′和5′′甲基分別與C-3′′和C-2′′相連。1H-1H COSY譜（圖2）進一步證實，H-1 (δH5.72, 1H) 和H-6 (δH2.94, 1H) 相連，H-6 (δH2.94, 1H) 和H-5 (δH2.61, 1H;δH2.16, 1H) 相連，H-5 (δH2.61, 1H;δH2.16, 1H) 和H-4 (δH3.55, 1H)相連；H-8 (δH5.21, 1H) 和H-9 (δH2.42, 2H) 相連，H-9 (δH2.42, 2H) 和H-10 (δH5.11, 1H) 相連；H-2′(δH5.76, 1H) 和H-3′ (δH7.35, 1H) 相連；H-3′′ (δH6.16, 1H) 和 H-4′′ (δH1.98, 3H) 相連。結(jié)合1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC及1H-1H COSY譜，化合物1的平面結(jié)構(gòu)確定為1-(cis-methylthioacryloyloxy)-8-angeloyloxy-3,4-epoxy-bisabola-7(14),10-diene。

表1 化合物1的1H和13C-NMR數(shù)據(jù) (500/125 MHz, CD3OD)Table 1 1H and 13C-NMR data of compound 1 (500/125 MHz, CD3OD)

圖2 化合物1的HMBC (H→C) 和1H-1H COSY (?) 關鍵相關信號Fig.2 Key HMBC (H→C) and 1H-1H COSY (?)correlations of compound 1

ROESY譜（圖3）顯示，H-4與H-15相關，H-1與H-8相關，H-4與H-1、H-8均沒有相關信號。參考文獻已報到的相似倍半萜骨架[12]，將H-6定義為α-H，根據(jù)J1,6值 (12.8 Hz) H-1則為β-H，H-8同樣為β-H；由于H-4與H-1無相關，且參考J4,5偶合常數(shù)值 (4.3 Hz)，H-4則為α-H，H-15同樣為α-H。綜上，化合物1的相對構(gòu)型確定為1α-(cismethylthioacryloyloxy)-8α-angeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene，經(jīng)文獻及數(shù)據(jù)庫檢索確定為新化合物，命名為毛裂蜂斗菜素。

圖3 化合物1的ROESY關鍵相關信號Fig.3 Key ROESY correlations of compound 1

化合物2：白色無定形粉末（甲醇）；EI-MSm/z:466 [M-H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 7.09(1H, d,J= 10.2 Hz, H-3′′), 6.93 (1H, d,J= 10.0 Hz,H-3′), 5.83 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-9), 5.81 (1H, d,J=10.2 Hz, H-2′′), 5.53 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-2′), 5.19(1H, s, H-13a), 5.14 (1H, s, H-13b), 5.14 (1H, dt,J=11.5, 5.3 Hz, H-1), 4.65 (2H, brs, H-12), 2.74 (1H, dd,J= 11.4, 5.1 Hz, H-10), 2.39 (3H, s, H-4′′), 2.35 (3H,s, H-4′), 2.23 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6a), 1.94 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6b), 1.83 (1H, m, H-2a), 1.79 (1H, m,H-2b), 1.66 (1H, m, H-3a), 1.57 (1H, m, H-4), 1.34(1H, dddd,J= 16.5, 13.3, 13.3, 4.3 Hz, H-3b), 1.10(3H, s, H-15), 0.89 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 177.9 (C-8), 165.7(C-1′), 165.2 (C-1′′), 153.3 (C-3′′), 151.9 (C-3′), 147.9(C-11), 113.0 (C-2′), 112.4 (C-2′′), 108.0 (C-13), 80.6(C-9), 70.7 (C-12), 70.1 (C-1), 55.0 (C-7), 51.9(C-10), 45.7 (C-6), 43.2 (C-5), 35.4 (C-4), 29.5 (C-3),26.8 (C-2), 19.6 (C-15), 19.2 (C-4′, 4′′), 15.6 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物2為bakkenolide IIIb。

化合物3：白色無定形粉末（甲醇）；ESI-MSm/z:287.1 [M+Na]+, 550.9 [2M+Na]+；1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 5.30 (2H, dt,J= 16.3, 2.3 Hz,H-13), 4.86 (2H, dt,J= 13.9, 2.3 Hz, H-12), 4.58 (1H,d,J= 11.2 Hz, H-9), 2.91 (1H, dd,J= 11.2, 1.3 Hz,H-10), 2.70 (1H, m, H-3a), 2.27 (1H, m, H-3b), 2.09(1H, m, H-4), 2.06 (2H, brs, H-6), 1.96 (1H, m, H-2a),1.68 (1H, dddd,J= 17.9, 13.7, 4.5, 4.4 Hz, H-2b),1.08 (3H, s, H-15), 1.02 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 212.8 (C-1), 179.9(C-8), 148.7 (C-11), 106.0 (C-13), 85.1 (C-9), 70.7(C-12), 67.1 (C-10), 57.9 (C-7), 45.9 (C-6), 45.4(C-5), 38.1 (C-3), 36.9 (C-4), 31.0 (C-2), 19.4 (C-15),14.3 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物3為monoketone。

化合物4：白色無定形粉末（甲醇）；ESI-MSm/z:473.2 [M+Na]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 7.04(1H, d,J= 10.0 Hz, H-3′), 5.77 (1H, d,J= 11.1 Hz,H-9), 5.62 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-2′), 5.21 (1H, s,H-13a), 5.17 (1H, s, H-13b), 5.15 (1H, dt,J= 12.2,4.9 Hz, H-1), 4.68 (2H, s, H-12), 2.75 (1H, dd,J=11.1, 4.8 Hz, H-10), 2.39 (3H, s, H-4′), 2.25 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6a), 2.14 (2H, m, H-2′′), 2.06 (1H, m,H-3′′), 1.95 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6b), 1.80 (1H, m,H-2a), 1.72 (1H, m, H-2b), 1.66 (1H, m, H-3a), 1.58(1H, m, H-4), 1.38 (1H, m, H-3b), 1.11 (3H, s, H-15),0.95 (6H, d,J= 6.5 Hz, H-4′′, 5′′), 0.90 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 177.5(C-8), 171.9 (C-1′′), 165.6 (C-1′), 152.5 (C-3′), 147.9(C-11), 112.5 (C-2′), 108.2 (C-13), 80.5 (C-9), 70.4(C-12), 70.3 (C-1), 54.7 (C-7), 51.9 (C-10), 46.2(C-6), 43.3 (C-2′′), 43.3 (C-5), 35.2 (C-4), 29.5 (C-3),26.7 (C-2), 25.1 (C-3′′), 22.5 (C-5′′), 22.4 (C-4′′), 19.5(C-15), 19.2 (C-4′), 15.5 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物4為japonipene C。

化合物5：白色無定形粉末（甲醇）；ESI-MSm/z:413.2 [M+Na]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 5.76(1H, d,J= 11.2 Hz, H-9), 5.45 (1H, brs, H-2′), 5.20(1H, brs, H-13a), 5.17 (1H, brs, H-13b), 5.09 (1H, dt,J= 12.1, 4.9 Hz, H-1), 4.67 (2H, m, H-12), 2.74 (1H,dd,J= 11.2, 4.9 Hz, H-10), 2.24 (1H, d,J= 15.0 Hz,H-6a), 2.14 (3H, brs, H-5′), 2.02 (3H, s, H-2′′), 1.95(1H, d,J= 15.0 Hz, H-6b), 1.84 (3H, brs, H-4′), 1.79(2H, m, H-2), 1.67 (1H, m, H-3a), 1.57 (1H, m, H-4),1.36 (1H, m, H-3b), 1.11 (3H, s, H-15), 0.91 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ:177.7 (C-8), 170.0 (C-1′′), 165.5 (C-1′), 157.1 (C-3′),147.8 (C-11), 115.9 (C-2′), 108.3 (C-13), 80.9 (C-9),70.6 (C-12), 69.5 (C-1), 54.9 (C-7), 51.7 (C-10), 45.8(C-6), 43.3 (C-5), 35.4 (C-4), 29.6 (C-3), 27.4 (C-4′),26.8 (C-2), 21.2 (C-2′′), 20.1 (C-5′), 19.6 (C-15),15.6 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物5為petatewalide A。

4 討論

本實驗從毛裂蜂斗菜50%乙醇提取物中分離并鑒定了5個倍半萜類化合物，包括1個新化合物（1）以及4個首次從該植物中分離得到的螺內(nèi)酯類化合物（2～5）。本課題組通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，具有與化合物1相同骨架的特征型環(huán)氧倍半萜類結(jié)構(gòu)僅從菊科植物厚敦菊屬[17]、冬泉菊屬[18]、款冬屬[11,19]和橐吾屬[20]植物中分離得到，本研究證實菊科蜂斗菜屬植物同樣存在特征型的環(huán)氧倍半萜類化合物。由于菊科植物在外部形態(tài)方面存在嚴重的同塑性演化，且菊科千里光族亞族內(nèi)各屬系統(tǒng)位置及親緣關系的劃分依然是學術界爭論的焦點[21]，本研究在豐富蜂斗菜屬植物倍半萜類化合物類型的同時，可從植物次級代謝產(chǎn)物合成生源途徑方面為千里光族亞族群的劃分提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突