中藥多糖防治骨質(zhì)疏松癥作用及機(jī)制的研究進(jìn)展

劉廣臣，張紅梅，楊 帆，魯 明，劉振剛，盛 瑜，張伯寅*

1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長春 130033

2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春 130031

3.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種常見的進(jìn)行性的全身骨骼疾病，它以伴有微結(jié)構(gòu)破壞的骨密度降低為特點(diǎn)，表現(xiàn)為骨脆性的增加，進(jìn)而導(dǎo)致骨折的危險(xiǎn)性升高[1]。OP是一種與年齡、全身代謝、激素影響、遺傳因素有關(guān)的復(fù)雜疾病，50歲以上的女性人群患病率約為33.3%，男性約為25.0%，雖然女性骨質(zhì)疏松癥的患病率較高，但男性骨折后死亡率較高[2-3]。OP可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性3大類，其中，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥包括更年期/絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（I型）、老年骨質(zhì)疏松癥（II型）；繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥指由任何影響骨代謝的疾病和/或藥物及其他明確病因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松，誘發(fā)原因包括性腺功能減退（包括前列腺癌雄激素剝奪治療的男性）、酗酒、糖皮質(zhì)激素過量（內(nèi)源性或外源性）、吸收不良（包括炎癥性腸病、原發(fā)性膽汁性肝硬化和胃轉(zhuǎn)流術(shù)后），慢性腎臟疾?。ㄏ嚓P(guān)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)）、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能亢進(jìn)、系統(tǒng)性疾?。◥盒阅[瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肥大細(xì)胞增多）、慢性阻塞性肺疾病、1型和2型糖尿病、人類免疫缺陷病毒感染、炎性風(fēng)濕性疾病以及使用抗驚厥藥和化療藥物等；特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥特指70歲以下的男性和青少年患有骨質(zhì)疏松癥[4-5]。隨著人類預(yù)期壽命的增加和人口老齡化的加劇，OP為世界范圍內(nèi)的代謝性骨病，在預(yù)防和治療方面已受到了人們極為廣泛的關(guān)注。

目前，雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素和雷洛昔芬是治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物[6]。然而，這些藥物的不良反應(yīng)嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用，如雌激素等激素相關(guān)療法可以維持骨密度，但會(huì)增加患癌癥、血栓和心臟病的風(fēng)險(xiǎn)；雙膦酸鹽可以抑制骨吸收并促進(jìn)骨形成，但它會(huì)引起食道炎癥和胃潰瘍等胃腸道問題[7-8]。因此，需要研發(fā)更多不良反應(yīng)少的藥物來防治OP。中藥因其具有整體治療效果較好、不良反應(yīng)少、適合長期使用的特點(diǎn)而逐漸成為OP臨床研究的熱點(diǎn)。

多糖是由10個(gè)或10個(gè)以上的單糖通過脫水作用而形成的具有α或β糖苷鍵的一類鏈狀高分子聚合物，幾乎存在于所有的生物中[9]，并在中藥材中含量尤為豐富。大量研究表明，中藥多糖及其衍生物具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、護(hù)肝、降血糖等藥理活性[10]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖對OP具有較好的防治作用，但缺乏對其系統(tǒng)性的報(bào)道，因此，本文對中藥多糖防治OP的作用及機(jī)制等研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期推動(dòng)其在相關(guān)的醫(yī)藥領(lǐng)域的深入開發(fā)及應(yīng)用。

1 防治OP的中藥多糖來源

中醫(yī)藥防治OP歷史悠久，稱其為“骨痹”“骨萎”“骨枯”，病位在骨，實(shí)與肝脾腎三臟相關(guān)，幾千年來，治療OP多采用補(bǔ)腎填精、健脾、活血化瘀的中藥[11]。目前，已研究具有防治OP功效的中藥多糖，多來源于藥用植物，以滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的中藥材居多，包括巴戟天、牛膝、枸杞、（川）續(xù)斷、淫羊藿、狗脊、鎖陽等；同時(shí)，具有健脾、潤肺、益腎功效的黃精研究也較為廣泛；此外，其他功效的中藥材研究相對較為零散，包括黃芪、荷葉、當(dāng)歸、沒藥、肉蓯蓉、天麻、石菖蒲、鐵皮石斛、防風(fēng)等。除藥用植物外，鹿茸作為動(dòng)物藥材，其多糖也具有一定防治OP的功效。

2 中藥多糖防治OP的作用及機(jī)制

2.1 具有促進(jìn)成骨和抑制破骨雙重作用的中藥多糖

2.1.1 牛膝多糖（Achyranthes bidentatapolysaccharide，ABP） 從牛膝中提取分離出粗多糖AB50、AB70、ABPB及一系列精制多糖ABW50-1、ABW70-1、ABPB-3、ABPB-4等，其中400 mg/(kg·d)粗多糖AB50、AB70和ABPB均能顯著提高卵巢切除大鼠的骨密度、骨礦含量、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）和生物力學(xué)特性，降低骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp），同時(shí)，AB50、AB70能夠顯著降低血清中骨成熟標(biāo)志物I型前膠原氨基端原肽（procollagen IN-terminal propeptide，PINP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、I型膠原蛋白C末端交聯(lián)肽（C-terminal cross linked peptide，CTX）含量，說明AB50、AB70和ABPB對卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松有顯著的治療作用[12-14]。在斑馬魚糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIO）模型中，牛膝多糖ABPB-3（0.032 4～0.518 0 μmol/L）和ABW50-1（2.62～23.82 μmol/L）以濃度相關(guān)性的方式顯著增加顱骨的相對熒光強(qiáng)度，提示ABPB-3和ABW50-1具有促進(jìn)成骨活性的作用[12,14]。此外，ABW70-1（50 μg/mL）和ABPB-4（0.01 μmol/L）可通過促進(jìn)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、礦物結(jié)節(jié)形成及細(xì)胞中成骨相關(guān)基因鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、OCN、骨唾液酸蛋白基因（bone sialoprotein，BSP）和骨橋素基因（osteopontin，OPN）表達(dá)，促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化[13,15]。

破骨細(xì)胞的發(fā)生是由核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）啟動(dòng)的，RANKL和MCSF分別與破骨細(xì)胞前體表面的受體RANK和巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體c-FMS結(jié)合，并激活許多關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[16]。活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1）是RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成所必需的蛋白質(zhì)，以高度磷酸化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在RANKL和RANK相互作用引起細(xì)胞內(nèi)鈣水平波動(dòng)后，NFATc1去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核以刺激破骨細(xì)胞特異性的基因表達(dá)，包括整合素β3（Integrin β3）、人抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，ACP5/TRACP）和組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK），此外，NFATc1的表達(dá)受原癌基因蛋白c-FOS調(diào)控。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是由脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，傳統(tǒng)的MAPK包括p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2、ERK5和c-JUN氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）1/2/3 3個(gè)亞家族成員。已經(jīng)證明MAPK通路是破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵途徑，如磷酸化JNK可以誘導(dǎo)激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）活化，從而刺激破骨細(xì)胞前分化、存活、融合和成熟破骨細(xì)胞的激活；p38磷酸化的抑制影響破骨細(xì)胞的生成和骨吸收；ERK途徑可激活c-FOS的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)骨吸收破骨細(xì)胞的分化。Song等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓單核細(xì)胞/骨髓巨噬細(xì)胞中，牛膝多糖10 μmol/L可以抑制由RANKL誘導(dǎo)的蛋白JNK、ERK、p38的磷酸化以及NFATc1、c-FOS、CTSK、Integrin β3的活化，從而抑制破骨細(xì)胞生成，即ABP可能通過抑制MAPK和NFATc1信號通路防治OP。

上述研究中，Yan等[14]將斑馬魚作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型，避免了多糖研發(fā)過程中相對分子質(zhì)量均一成分制備量少與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)耗樣量大之間的矛盾，是多糖研究中揚(yáng)長避短的典型。

2.1.2 黃精多糖（Polygonatum sibiricumpolysaccharide，PSP） 經(jīng)典Wnt信號通路，即Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路與刺激成骨分化、骨形成和預(yù)防骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，且具有雙向調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞外Wnt信號蛋白與質(zhì)膜受體結(jié)合后，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)積聚并進(jìn)入細(xì)胞核，隨后通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)以及T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)Wnt最終作用的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，從而引起后續(xù)的細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在無Wnt信號時(shí)，GSK3β能將磷酸基團(tuán)結(jié)合至β-catenin N端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，磷酸化的β-catenin經(jīng)β-轉(zhuǎn)錄重復(fù)包含蛋白（β-transducin repeat containing protein，β-TRCP）泛素化共價(jià)修飾后，被蛋白酶體降解。Wnt/β-catenin信號通路在功能上與蛋白激酶Hippo（Hpo）、I型膜蛋白NOTCH和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等類似，并與發(fā)育調(diào)控相關(guān)的信號通路有著不同程度的交聯(lián)。Hpo通路參與成骨分化，其下游核心轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP/TAZ（Yes-associated protein/tafazzin）能與成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，RUNX2）結(jié)合入核，促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)成骨分化，同時(shí)，磷酸化的TAZ能夠直接結(jié)合β-catenin蛋白從而促使其滯留細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不能入核，從而抑制了成骨分化。張磊[18]研究發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中，黃精多糖25 mg/L能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中TAZ、RUNX2、ALP、OCN基因表達(dá)，并能通過阻止Hpo信號通路中TAZ蛋白降解從而促進(jìn)BMSCs的成骨分化，并不影響其細(xì)胞增殖，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，黃精多糖800 mg/(kg·d)能阻止去卵巢大鼠的骨密度下降，骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)破壞，發(fā)揮骨質(zhì)疏松癥的防治作用。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖能通過ERK/GSK3β/β-catenin信號通路在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化[19]。

LIMD1（LIM domain-containing protein 1）參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、分化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，是Hpo信號通路重要的下游信號分子，也是miR-1224調(diào)控的重要靶基因。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中，黃精多糖在抑制破骨細(xì)胞生成時(shí)，細(xì)胞中有27個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中最顯著的是miR-1224，進(jìn)一步研究表明，黃精多糖可有效減弱miR-1224進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞內(nèi)LIMD1蛋白表達(dá)，由此可知，黃精多糖以通過抑制miR-1224來減弱Hpo信號通路對破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。

上述研究主要體現(xiàn)了黃精多糖可通過Hpo信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞分化，不僅證實(shí)了黃精多糖防治OP的作用和機(jī)制，也間接說明Hpo信號通路在OP防治中具有重要作用，通路蛋白可作為防治OP的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.1.3 黃芪多糖（Astragaluspolysaccharides，APS） 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）與多種細(xì)胞因子形成BMP-2信號通路，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌。BMP-2與靶細(xì)胞表面絲氨酸/蘇氨酸受體（BMPR-I、BMPR-II）結(jié)合而發(fā)揮作用。BMP-2與BMPR-II結(jié)合后構(gòu)成二聚體，BMPR-I與其特異性結(jié)合并發(fā)生自身磷酸化，激活受體調(diào)控因子Smad 1、5、8，再與Smad 4結(jié)合并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，以介導(dǎo)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。張小鈺等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖400 mg/(kg·d)可以通過上調(diào)卵巢切除大鼠體內(nèi)的BMP-2、p-Smad 1和p-Smad 5的表達(dá)，顯著激活BMP-2/Smads信號通路，促進(jìn)成骨分化，降低大鼠血清中ALP和破骨細(xì)胞水平，增加血鈣含量，增加股骨骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、表面積體積分?jǐn)?shù)（BS/TV）、Tb.Th、Tb.N，減少Tb.Sp，改善骨微結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮防治OP的作用。

炎癥除了在許多慢性疾病中扮演重要角色外，也是OP的高危因素。促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），可促進(jìn)破骨細(xì)胞生成并阻止成骨細(xì)胞分化，參與OP的發(fā)生。白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）在骨質(zhì)疏松婦女中顯著升高，并被認(rèn)為在絕經(jīng)后OP中起重要作用。ACP5是破骨細(xì)胞分化的重要生物標(biāo)志物。多糖作為生物大分子不能被宿主來源的酶降解為胃和小腸中可吸收的單糖，因此它們大部分流入大腸，成為腸道微生物的發(fā)酵底物，并影響機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在GIO大鼠模型中，黃芪多糖可以恢復(fù)骨密度和修復(fù)骨微結(jié)構(gòu)的損傷，并可使大鼠體內(nèi)ACP5和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-2顯著降低，同時(shí)，顯著改變了大鼠腸道微生物群（如c_Bacteroidia、p_Bacteroidetes、g_Allpprevotella）的結(jié)構(gòu)和功能，這些細(xì)菌相對豐度的變化與ACP5和TNF-α水平的降低相關(guān)聯(lián)，上述結(jié)果提示黃芪多糖150 mg/(kg·d)可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制炎癥，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的生成改善OP。DNA甲基化是一種表觀遺傳學(xué)事件，Liu等[23]通過基于差異甲基化位點(diǎn)的基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，在GIO大鼠模型中，黃芪多糖150 mg/(kg·d)能夠使OP相關(guān)的基因啟動(dòng)子DNA甲基化發(fā)生變化，包括鈣穩(wěn)態(tài)、破骨細(xì)胞/成骨細(xì)胞平衡、Wnt信號通路和激素相關(guān)過程，初步闡明了黃芪多糖改善OP的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

上述研究中，將微生物腸道菌群、炎癥、基因組學(xué)等疾病研究的熱點(diǎn)應(yīng)用于中藥多糖防治OP的探索中，體現(xiàn)了中藥多糖在疾病治療時(shí)多靶點(diǎn)、多維度的作用優(yōu)勢。

2.1.4 防風(fēng)多糖（Saposhnikovia divaricatapolysaccharide，SPS） OP患者血清中Ca2+、Mg2+濃度大幅增，P2?通常與兩者濃度呈負(fù)相關(guān)，因此，Ca2+、Mg2+、P2?常作為骨代謝常用檢測指標(biāo)。ALP與成骨細(xì)胞及前成骨細(xì)胞活性呈線性相關(guān)，成骨細(xì)胞活性越高，ALP水平越高。IL-6、TNF-α等免疫調(diào)節(jié)因子能夠通過作用于NF-κB受體，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，參與OP的發(fā)生和發(fā)展。TGF-β1、一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（NO synthase，NOS）等因子能夠抑制破骨細(xì)胞形成、成熟或促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖，抑制骨吸收。徐俊[24]研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)多糖500 mg/(kg·d)作用于卵巢切除大鼠，能夠有效降低其血清中Ca2+、Mg2+、ALP和IL-6、TNF-α的濃度，提高P2?、TGF-β1、NO、NOS的濃度，增加股骨干質(zhì)量，緩解卵巢切除大鼠的骨吸收狀態(tài)，達(dá)到治療效果。

2.1.5 續(xù)斷多糖（Dipsacus asperpolysaccharide，DAP） 在血管生成方面，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在向骨組織供血中起著至關(guān)重要的作用，其缺乏最終會(huì)加重OP。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B，（protein kinase B，Akt）/內(nèi)皮型NO合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）信號通路是VEGF下游分子，VEGF能夠誘導(dǎo)Akt的磷酸化，進(jìn)而磷酸化下游eNOS底物，誘導(dǎo)隨后的NO生成，最終促進(jìn)血管生成的發(fā)生，因此PI3K/Akt/eNOS信號通路促進(jìn)血管生成可以改善骨組織的局部血供，從而促進(jìn)成骨的進(jìn)程。RANKL與RANK的結(jié)合能促進(jìn)骨重吸收，抑制破骨細(xì)胞凋亡。骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志物，能抑制前成骨細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化。OPG作為競爭性誘餌受體，能夠阻止RANKL與RANK的結(jié)合，有效抑制破骨細(xì)胞分化，預(yù)防過度骨吸收。因此，OPG、RANKL和RANK是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子，打破RANKL和OPG的平衡會(huì)導(dǎo)致OP。Sun等[25]研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷多糖100 mg/(kg·d)可顯著防止卵巢切除引起的大鼠骨丟失、生物力學(xué)降低和體質(zhì)量下降，以及提高U-Ca/Cr、U-P/Cr、ALP、甲狀腺受體輔助蛋白（triiodothyronine receptor auxiliary protein，TRAP）水平，進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，DAP誘導(dǎo)的抗OP作用是通過在蛋白和mRNA水平上調(diào)VEGF和OPG的表達(dá)，下調(diào)RANK和RANKL的表達(dá)，以及激活PI3K/Akt/eNOS信號通路實(shí)現(xiàn)的，由此可知，DAP能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的分化和功能，具有預(yù)防和治療絕經(jīng)后OP的作用。

2.2 具有促進(jìn)成骨作用的中藥多糖

2.2.1 巴戟天多糖（Morinda officinalispolysaccharide，MOP） Zhang等[26]從巴戟天中提取分離出粗多糖以及一系列精制多糖MO50、MOW50-1、MOP50-2、MO70、MOP70-1、MOP70-2、MO90、MOW90-1等。研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天粗多糖400 mg/(kg·d)對卵巢切除引起的大鼠骨丟失和生物力學(xué)功能障礙有明顯的保護(hù)作用，巴戟天粗多糖組大鼠的骨小梁微結(jié)構(gòu)退化程度減輕，骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物［包括CTX、骨特異性堿性磷酸酶（bone specific alkaline phosphatase，BAP）、PINP、HYP］水平降低，體外實(shí)驗(yàn)表明，MOW50-1 50 μg/mL可通過增加ALP活性，從而促進(jìn)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1的成骨分化。RUNX 2是RUNT結(jié)構(gòu)域基因家族的成員，是經(jīng)典Wnt/βcatenin信號通路的重要下游基因，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，RUNX 2與OSX是調(diào)控早期成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；BSP、OCN和OPN基因參與終末成骨細(xì)胞分化和骨礦化。研究發(fā)現(xiàn)，MOP70-1 40.1 μmol/L和MOP70-2 32.2、80.4 μmol/L能顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化和礦化，其中，化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的MOP70-2 16.1 μmol/L能夠通過上調(diào)成骨分化相關(guān)標(biāo)記基因RUNX 2、OCN、OPN、BSP、OSX等表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[27]。此外，MOW90-1 50 mg/mL通過在成骨分化的早期上調(diào)RUNX 2和OSX基因的表達(dá)，晚期上調(diào)OCN和OPG基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[28]。

上述研究中，以粗多糖進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將純化制備的均一多糖進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，體現(xiàn)了多糖藥效學(xué)研究的基本思路，與生物大分子多肽不同，相對分子質(zhì)量均一的多糖人工合成能力有限，這在一定程度上成為了多糖研發(fā)的瓶頸。

2.2.2 枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP） 細(xì)胞凋亡是為了保持機(jī)體內(nèi)平衡由基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）參與細(xì)胞凋亡。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）在ERS中能通過抑制蛋白質(zhì)合成和增加蛋白質(zhì)降解保護(hù)細(xì)胞，在發(fā)生ERS時(shí)，GRP78的表達(dá)量顯著增高，是ERS的標(biāo)志性蛋白分子。持續(xù)的、過量或異常的ERS能夠通過CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）信號通路、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（cysteinyl aspartate specific proteinase-12，Caspase-12）信號通路和JNK信號通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Jing等[29]研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸鹽能夠通過引起ERS，提高細(xì)胞內(nèi)GRP78、CHOP、Caspase-12以及p-JNK的表達(dá)，最終導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。枸杞多糖800 μg/mL預(yù)處理上述細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞中GRP78、CHOP、Caspase-12以及p-JNK的表達(dá)相對降低，并以劑量相關(guān)的方式有效抑制成骨細(xì)胞凋亡。由此可知，枸杞多糖可能通過抑制ERS相關(guān)信號通路的激活，逆轉(zhuǎn)棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，具有防治OP的作用。成骨細(xì)胞的發(fā)育和成熟受大量旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌因子影響，其中包括BMP。miRNAs是長度為20～24個(gè)核苷酸單鏈非編碼RNA分子，通過內(nèi)源性基因編碼。miRNA可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和凋亡，在生物體的生長發(fā)育以及疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。TargetScan數(shù)據(jù)庫中顯示，BMP拮抗劑腱蛋白樣蛋白1（chordin like protein 1，CHRDL1）是miR-200b-3p靶基因，參與破骨細(xì)胞分化。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatorsactivated receptors γ，PPARγ）是前脂肪細(xì)胞分化過程中的一個(gè)重要調(diào)控因子，其激活可加速脂肪細(xì)胞分化，從而加重患者的肥胖。Jing等[30]經(jīng)生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)CHRDL1與PPARγ共表達(dá)，推測miR-200b-3p/CHRDL1/PPARγ軸與肥胖性O(shè)P相關(guān)，并認(rèn)為具有改善肥胖和抑制成骨細(xì)胞凋亡的LBP可通過該軸發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證明，枸杞多糖400 μg/mL顯著增加了由棕櫚酸鹽介導(dǎo)引起的CHRDL1mRNA降低，并抑制了由棕櫚酸鹽介導(dǎo)引起的miR-200b-3p和PPARγmRNA增加，提示在棕櫚酸鹽處理細(xì)胞中，枸杞多糖可通過調(diào)節(jié) miR-200b-3p/CHRDL1/PPARγ軸發(fā)揮一系列功能。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-200b-3p轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞可加重棕櫚酸鹽介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并增加PPARγ蛋白表達(dá)、降低CHRDL1蛋白表達(dá)，枸杞多糖400 μg/mL孵育細(xì)胞后可以減輕上述現(xiàn)象的發(fā)生，但當(dāng)si CHRDL1和抑制劑共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，LBP 400 μg/mL對棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用也被部分抑制。由此可知，LBP主要通過抑制miR-200b-3p上調(diào)CHRDL1而抑制棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，miR-200b-3p/CHRDL1/PPARγ軸不是LBP保護(hù)成骨細(xì)胞免受棕櫚酸鹽損傷的唯一機(jī)制。TGF-β1可經(jīng)多種途徑促進(jìn)人類成骨細(xì)胞的骨形成。骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和/或破骨細(xì)胞內(nèi)的NOS酶能夠促進(jìn)合成NO，NO-環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）通路與成骨細(xì)胞的凋亡活性相關(guān)，刺激NOcGMP通路可發(fā)揮骨重建的作用。任小軍等[31]研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖40 mg/(kg·d)可提高卵巢切除大鼠血清中NOS和TGF-β1的水平，進(jìn)而通過NO和TGFβ1介導(dǎo)的分子機(jī)制通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)骨重建代謝的作用。

2.2.3 淫羊藿多糖（Epimedium brevicornumpolysaccharide，EBP） GIO中細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚不清楚，但Caspase-3可能在本病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2家族蛋白（促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2）也通常參與GIO細(xì)胞凋亡。此外，PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路是細(xì)胞凋亡過程中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。Zheng等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在地塞米松誘導(dǎo)的原代成骨細(xì)胞凋亡模型中，淫羊藿多糖100 μg/mL預(yù)處理可完全逆轉(zhuǎn)模型中Caspase-3和Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)減少以及PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化，并可顯著上調(diào)低密度脂蛋白相關(guān)蛋白-5（low density lipoprotein receptor related protein-5，LRP-5）、βcatenin、RUNX 2和OSX的蛋白表達(dá)，由此可知，淫羊藿多糖預(yù)處理對成骨細(xì)胞的抗凋亡作用部分是通過調(diào)節(jié)Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，并主要依賴于抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，同時(shí)，可通過激活成骨細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的形成。

2.2.4 當(dāng)歸多糖（Angelica sinensispolysaccharide，AP） 細(xì)胞周期中DNA合成前期（G1期）是細(xì)胞周期啟動(dòng)點(diǎn)，調(diào)控G1期的細(xì)胞周期蛋白為細(xì)胞周期素D1蛋白（Cyclin D1），它可以與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶形成復(fù)合物，啟動(dòng)下游驅(qū)動(dòng)基因，使細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)而使細(xì)胞增殖。因此，Cyclin D1是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白。Bcl-2/Bax值的變化與成骨細(xì)胞凋亡相關(guān)。陳超群[11]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖0.5 mg/mL能夠促進(jìn)人成骨細(xì)胞處于S期，誘導(dǎo)其增殖，并減少其凋亡，能夠在RNA和蛋白水平，上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，并不影響B(tài)cl-2/Bax值變化，由此可知，在一定濃度范圍的當(dāng)歸多糖能夠促進(jìn)體外人成骨細(xì)胞增殖，可能與促進(jìn)Cyclin D1表達(dá)來進(jìn)一步使得細(xì)胞向S期分布這一機(jī)制相關(guān)。H19作為一種重要的長鏈非編碼RNA，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)控，它可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，并通過作為競爭性內(nèi)源性RNA激活Wnt信號通路，另外，它能通過NOTCH信號通路調(diào)節(jié)BMP-9誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化，在協(xié)調(diào)成骨中具有重要作用。Xie等[33]研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中當(dāng)歸多糖400 mg/(kg·d)能夠提高卵巢切除大鼠的骨密度、骨礦含量、股骨灰分和干質(zhì)量，體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)歸多糖300 μg/mL能夠提高BMSCs的細(xì)胞活力，上調(diào)Cyclin D1、RUNX 2、OCN、ALP和BMP-2的蛋白水平，并顯著激活BMSCs中PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號通路，H19基因敲除后，逆轉(zhuǎn)了當(dāng)歸多糖對細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，由此可知，當(dāng)歸多糖可以通過調(diào)節(jié)H19促進(jìn)BMSCs增殖和成骨細(xì)胞分化。

2.2.5 鐵皮石斛多糖（Dendrobium officinalepolysaccharide，DOP） 過度的氧化應(yīng)激和抗氧化防御能力的減弱可能會(huì)導(dǎo)致與年齡相關(guān)的組織損傷和各種疾病，包括OP。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor NF-E2-related factor 2，Nrf2）是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄活性的損傷會(huì)引起氧化應(yīng)激。Nrf2過度表達(dá)可提高BMSCs分化為成骨細(xì)胞系的潛能，降低其分化為成脂肪細(xì)胞系的潛能。小鼠體內(nèi)Nrf2的缺失會(huì)導(dǎo)致骨量和骨微結(jié)構(gòu)的降低。Peng等[34]研究發(fā)現(xiàn)，給予衰老小鼠服用DOP mg/(kg·d)可顯著增加Tb.V、Tb.N，降低Tb.Sp，減緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化應(yīng)激，增加骨髓中的成骨細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)減少骨髓中的脂肪細(xì)胞數(shù)量。體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)BMSCs暴露于氧化應(yīng)激中，DOP 200 μg/mL可提高細(xì)胞中Nrf2及其下游蛋白血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）的表達(dá)，提高成骨細(xì)胞標(biāo)志性物OSX和RUNX 2mRNA水平的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化，同時(shí)降低脂肪細(xì)胞標(biāo)志物PPARγ和脂肪酸結(jié)合蛋白4的表達(dá)，抑制脂肪細(xì)胞分化。此外，氧化應(yīng)激模型細(xì)胞給予Nrf2 siRNA后，DOP對BMSCs的效應(yīng)被消除。由此可知，DOP可以通過Nrf2抗氧化信號通路減輕骨丟失和提高骨密度。

2.2.6 狗脊多糖（Cibotium barometzpolysaccharide，CBB） 張夢柳[35]從狗脊中提取獲得去蛋白多糖CBB，精制后制備出一系列多糖CBB-1、CBB-2、CBB-3。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CBB-1 25 μg/mL可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，此外，CBB-1 50 μg/mL不僅可提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞中ALP活性，同時(shí)可提高該細(xì)胞的礦化率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CBB-1 100 μg/mL能夠顯著上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中OST、RUNX2基因及細(xì)胞分化中后期關(guān)鍵基因BSP和OCN的表達(dá)水平。黃冬[36]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，CBB能夠顯著增加卵巢切除大鼠股骨Tb.N、Tb.Th，降低Tb.Sp，改善結(jié)構(gòu)模型指數(shù)使其結(jié)構(gòu)由棒狀向板狀轉(zhuǎn)變，說明CBB具有顯著的抗骨質(zhì)疏松活性。

2.2.7 鹿茸多糖（Pilose antlerpolysaccharide，PAP）Ren等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢切除大鼠體內(nèi)，鹿茸多糖可通過激活BMP-2/Smad 1和Smad 5/RUNX 2信號通路，調(diào)節(jié)骨代謝，增加骨密度。

2.3 具有抑制破骨細(xì)胞作用的中藥多糖

目前，關(guān)于僅具有抑制破骨細(xì)胞生成和功能的中藥多糖的報(bào)道相對較少，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)多針對OP的骨丟失癥狀，體外實(shí)驗(yàn)多針對破骨細(xì)胞的生成及其特異性基因的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鎖陽多糖（Cynomorium songaricumpolysaccharide，CSP）[38]、天麻多糖WSS25[39]、荷葉多糖（polysaccharides from lotus leaves，LLEP）[40]、石菖蒲多糖（Acorus calamuspolysaccharides，ACP）[41]可改善卵巢切除或脂多糖誘導(dǎo)的大/小鼠骨丟失癥狀，其中CSP能夠提高大鼠體內(nèi)OPG蛋白表達(dá)，降低RANKL蛋白表達(dá)，升高OPG/RANKL值，其改善OP癥狀的機(jī)制與激活OPG/RANK/RANKL信號通路有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，天麻多糖WSS25 10 μg/mL、沒藥多糖（Commiphora myrrhapolysaccharide，WCM-PE）200 μg/mL[42]、LLEP 100 μg/mL、肉蓯蓉多糖（Cistanche deserticolapolysaccharide，CDP）10 μmol/L[43]、石菖蒲多糖125 μg/mL均能夠明顯抑制由RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，但它們發(fā)揮作用的機(jī)制略有不同，其中WCM-PE、LLEP主要通過下調(diào)c-FOS和NFATc1蛋白的表達(dá)而發(fā)揮作用；天麻多糖通過阻斷BMP-2/SMAD/分化蛋白抑制物1（inhibitor of differentiation 1，ID1）信號通路，肉蓯蓉多糖通過抑制MARK信號通路，石菖蒲多糖通過抑制磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2）/鈣離子（Ca2+）/蛋白磷酸酶2B-Aα，（protein phosphatase，2B-Aα）信號通路而抑制破骨細(xì)胞的生成。

3 結(jié)語

OP的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與內(nèi)分泌、免疫、遺傳、衰老、營養(yǎng)狀況、運(yùn)動(dòng)、外部環(huán)境等因素相關(guān)，其發(fā)病是涉及多個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜病理過程，多條信號通路在該過程中起重要的調(diào)控作用[44]。骨穩(wěn)態(tài)是通過維持骨形成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡得以實(shí)現(xiàn)，當(dāng)骨吸收大于骨形成時(shí)，該平衡被打破，導(dǎo)致骨密度下降，繼而引起OP的發(fā)生。在該平衡過程中，具有骨形成功能的成骨細(xì)胞和具有骨吸收功能破骨細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用，因此，目前中藥多糖防治OP主要通過多條信號通路調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡，以實(shí)現(xiàn)維持骨穩(wěn)態(tài)最佳狀態(tài)的目的[45-46]。

本文從基因、信號通路、成/破骨細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（骨代謝、生物力學(xué)、腸道菌群）等多維度的研究展示了中藥多糖防治OP的作用及機(jī)制（表1）。中藥多糖能夠通過對Wnt、PI3K/Akt、MAPKs、NFATc1、ERS、OPG/RANK/RANKL、Hpo、ERK/GSK3β/β-catenin、BMP-2/Smads、Cyclin D1、Nrf2等多種信號通路進(jìn)行調(diào)控（圖1），抑制或活化通路中相關(guān)因子的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的增殖、分化、成熟、活化或凋亡，以達(dá)到維持骨穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮抗OP的目的。由此可見，中藥多糖因具有多靶點(diǎn)、多層面、多效應(yīng)，不良反應(yīng)小、來源廣泛等優(yōu)勢，為OP的預(yù)防和治療帶來了更多的可能性。

圖1 中藥多糖對前成骨細(xì)胞和前破骨細(xì)胞的作用機(jī)制Fig.1 Mechanism of Chinese medicine polysaccharides on pre-osteoblasts and pre-osteoclasts

表1 中藥多糖防治OP的作用及機(jī)制Table 1 Effects and mechanisms of traditional Chinese medicine polysaccharides in prevention and treatment of osteoporosis

此外，目前關(guān)于中藥多糖防治OP的研究仍存在一定的局限性：多糖的提取純化工藝較為復(fù)雜，粗多糖的得率相對較高，但精制多糖的得率低，在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，往往制備的結(jié)構(gòu)明確的精制多糖的量不足以支撐體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，所以，現(xiàn)有關(guān)于中藥多糖防治OP的研究，多選用粗多糖進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究功效，精制多糖進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索機(jī)制。隨著動(dòng)物模型研究的發(fā)展，斑馬魚因樣品用量少等優(yōu)勢被逐漸應(yīng)用于OP模型的建立，斑馬魚模型應(yīng)用的普及有望打破多糖研究的制約，促進(jìn)中藥多糖防治OP取得更大的突破[47]。與此同時(shí)，Zhu等[48]基于金催化“俞氏”糖苷化反應(yīng)成功人工合成了迄今線性最長的128聚糖，也為多糖在藥物研究方面帶來了希望。

綜上所述，中藥多糖能夠有效預(yù)防和治療OP，進(jìn)一步探尋高活性的中藥多糖，明確其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及作用特點(diǎn)和機(jī)制，可為中藥防治OP開辟新的領(lǐng)域，中藥多糖在醫(yī)藥和保健品的研發(fā)方面蘊(yùn)含巨大的潛力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突