基于SCF/c-kit信號(hào)通路探討調(diào)胃承氣湯對(duì)腦出血急性期大鼠胃腸組織的影響

楊雪琳，唐 明，周立娟，修小惠，安朋朋，王佳寧

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東 青島 266011)

胃腸動(dòng)力障礙是腦出血急性期常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高達(dá)61.8%～80%[1-2]，可導(dǎo)致胃腸內(nèi)容物蓄積，胃腸菌群失調(diào)，釋放大量?jī)?nèi)毒素，進(jìn)而使胃腸功能衰竭，加重惡化腦出血患者的整體病情[3-4]。因此，早期干預(yù)治療腦出血后胃腸動(dòng)力障礙具有非常重要的意義。近年來(lái)，隨著腦腸軸理論的提出，從胃腸方面治療腦病逐漸被重視[5]。早在《中藏經(jīng)》中即有運(yùn)用通腑法治療卒中的記載，金元四大家劉完素亦提出對(duì)于“內(nèi)有便溺之阻格”之中風(fēng)可以運(yùn)用調(diào)胃承氣湯以蕩滌積滯[6]。課題組前期研究證實(shí)調(diào)胃承氣湯可以促進(jìn)腦出血急性期患者顱內(nèi)血腫的吸收，緩解神經(jīng)功能缺損癥狀[7]；可以增強(qiáng)胃腸動(dòng)力[8]，保護(hù)胃腸黏膜[9]；可以清理腸道，調(diào)節(jié)腸道菌群[10]，降低血漿大腸桿菌內(nèi)毒素水平[11]，減輕卒中后內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的損害。但是調(diào)胃承氣湯促進(jìn)胃腸平滑肌收縮、調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力的具體作用機(jī)制尚不明確，因此本研究擬通過(guò)觀察調(diào)胃承氣湯對(duì)腦出血急性期模型大鼠胃腸組織中c-kit、SCF蛋白及mRNA表達(dá)的影響，初步探索調(diào)胃承氣湯改善胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠40只，10周齡，體重(200±20)g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0002。動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫25 ℃，相對(duì)濕度60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)流程和大鼠處理過(guò)程遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及制備 調(diào)胃承氣湯組方：大黃12 g、甘草6 g、芒硝9 g，中藥采用顆粒劑，轉(zhuǎn)換為顆粒共12.6 g，均購(gòu)于北京康仁堂藥業(yè)有限公司。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人與動(dòng)物等效劑量換算公式，計(jì)算出大鼠中藥的等效劑量為1.134 g/(kg·d)，加入適量蒸餾水配成113.4 mg/mL的懸濁液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。枸櫞酸莫沙必利片由魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：5 mg/片，加入適量蒸餾水制備成0.135 mg/mL的懸濁液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 c-kit抗體(中國(guó)wanleibio，批號(hào)：WL00125)；SCF抗體(中國(guó)wanleibio，批號(hào)：WL02436)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL發(fā)光液以及Western洗滌液(中國(guó)wanleibio)；Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、TRIpure裂解液(北京BioTeke)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)；WD-9405B水平搖床、DYY-7C電泳儀、DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽(北京六一公司)；Exicycler 96熒光定量PCR儀(韓國(guó)BIONEER)；紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo)。

1.4動(dòng)物建模、分組及干預(yù) 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥組，每組10只。假手術(shù)組只進(jìn)針不注入(作為對(duì)照以排除進(jìn)針損傷顱腦組織對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響)；其余組大鼠參考文獻(xiàn)[12],采用自體血注入法制備大鼠腦出血模型，根據(jù)神經(jīng)功能缺損癥狀，按照Longa五級(jí)評(píng)分法，以1～3分大鼠為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。建模成功后即刻，中藥組和西藥組分別給予113.4 mg/mL的調(diào)胃承氣湯懸濁液和0.135 mg/mL的莫沙必利懸濁液10 mL/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組和模型組予以等容量生理鹽水灌胃，2次/d，均連續(xù)灌胃7 d。

1.5觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.5.1胃腸組織中c-kit、SCF蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)。常規(guī)處死大鼠，分別切取胃、小腸、大腸、盲腸，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。然后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF 膜，封閉，卵育一抗，卵育二抗，ECL底物發(fā)光，將膠片結(jié)果掃描進(jìn)計(jì)算機(jī)，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。結(jié)果用c-kit、SCF條帶平均光密度/β-actin條帶平均光密度表示。

1.5.2胃腸組織中c-kit、SCFmRNA表達(dá)情況采用RT-PCR法檢測(cè)。取各組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸組織樣本，應(yīng)用TRIpure裂解液提取樣本總RNA，運(yùn)用電泳和紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，將cDNA加入到RT-PCR反應(yīng)體系中,進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)用ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析。引物序列及長(zhǎng)度：c-kit 上游5’-TGCCCGAAACAAGTCATCTC-3’，下游5’-TGAGGGTTCAACTTTATCCACAT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度109 bp；SCF上游5’-GATAACCCTCAACTATGTCG-3’，下游5’-TTACTCAAGCCTTCAGAAAT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度135 bp；β-actin 上游5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3’，下游5’-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度155 bp。采用2-ΔΔCT法計(jì)算各組織中c-kit和SCF mRNA表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠胃腸組織中c-kit、SCF蛋白表達(dá)情況 模型組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸平滑肌組織中c-kit、SCF蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，西藥組、中藥組大鼠胃腸各組織中c-kit、SCF蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，西藥組和中藥組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖1及表1、表2。

表1 假手術(shù)組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中c-kit蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

表2 假手術(shù)組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中SCF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.2各組大鼠胃腸組織中c-kit、SCFmRNA表達(dá)情況 模型組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸平滑肌組織中c-kit、SCFmRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，西藥組、中藥組大鼠胃腸各組織中c-kit、SCFmRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，西藥組和中藥組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3及表4。

表3 假手術(shù)組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中c-kit mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表4 假手術(shù)組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中SCF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

腦出血屬于中醫(yī)理論中“中風(fēng)”的范疇，《金匱要略》中指出中風(fēng)有“中臟”、“中腑”之分，中臟多偏里、中腑多偏表，清代醫(yī)家沈金鰲認(rèn)為大便秘結(jié)是中風(fēng)病邪入里的標(biāo)志，故急性腦出血伴半身不遂、昏迷、便秘、舌苔黃膩者辨證多屬中風(fēng)偏里之中臟，其發(fā)病機(jī)制與機(jī)體氣血逆亂、升降失調(diào)有關(guān)。氣血逆亂上沖于腦，神竅阻閉，故猝然昏撲，不省人事；氣機(jī)失調(diào)，樞機(jī)不利，影響脾之升清、胃之降濁，氣機(jī)更加壅滯，腸腑傳導(dǎo)不暢，腑氣不通，故大便秘結(jié)；加之痰濁、瘀血、火熱等邪氣壅滯胃腸道，實(shí)邪瘀積肆虐，繼而加重患者的整體病情[13]。正所謂“急則治其標(biāo)”“上病下取”，故對(duì)于腑實(shí)不通的急性腦出血患者，在辨證論治的基礎(chǔ)上選用通腑法治療，可以泄逐壅滯、祛邪外出，使氣血調(diào)暢，神志清明，達(dá)到諸癥皆緩的療效。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，腦出血急性期胃腸動(dòng)力的改變由中樞及胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)的共同調(diào)節(jié)而致，胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)主要與Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)有關(guān)。ICC存在于胃腸神經(jīng)與平滑肌細(xì)胞之間[14]，可以整合胃腸神經(jīng)信息傳遞至平滑肌細(xì)胞，起搏胃腸道的慢波活動(dòng)[15]，調(diào)控胃腸節(jié)律性運(yùn)動(dòng)[16]，ICC的數(shù)量以及形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變是影響胃腸道動(dòng)力的直接因素。c-kit受體(CD117)是ICC的特異性標(biāo)志物，SCF則是c-kit的天然配體，當(dāng)兩者結(jié)合形成二聚體后，迅速發(fā)生磷酸化會(huì)激活SCF/c-kit信號(hào)通路，并通過(guò)相應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響ICC的增生、分化以及表型的維持[17]。機(jī)體在毒物刺激、應(yīng)激、缺氧、炎性介質(zhì)等外源性因素影響下，c-kit表達(dá)會(huì)下降，SCF/c-kit信號(hào)通路異常改變，ICC數(shù)目相應(yīng)減少、細(xì)胞分化也相對(duì)不完整，胃腸動(dòng)力發(fā)生障礙；當(dāng)c-kit表達(dá)恢復(fù)后，ICC的數(shù)目和分化程度可恢復(fù)，胃腸動(dòng)力障礙亦有恢復(fù)[18]。因此，從SCF/c-kit信號(hào)通路研究胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病已成為一個(gè)嶄新的方向[19]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸平滑肌組織中c-kit、SCF蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯下降；調(diào)胃承氣湯及沙莫必利干預(yù)后，大鼠胃腸道組織中上述指標(biāo)均明顯升高。該結(jié)果表明腦出血急性期大鼠在機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)下或由于機(jī)體內(nèi)毒素的增多，導(dǎo)致SCF/c-kit信號(hào)通路相關(guān)蛋白、基因表達(dá)異常，進(jìn)而影響胃腸運(yùn)動(dòng)；而調(diào)胃承氣湯可以通過(guò)對(duì)c-kit、SCF蛋白及mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)，恢復(fù)腦出血急性期大鼠胃腸SCF/c-kit信號(hào)通路，促進(jìn)ICC的發(fā)育和分化，進(jìn)而促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，改善胃腸動(dòng)力障礙。然而腦出血急性期胃腸動(dòng)力障礙的原因有很多，調(diào)胃承氣湯是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)改善腦出血急性期胃腸動(dòng)力障礙，以及調(diào)胃承氣湯對(duì)ICC的數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)的具體影響等均有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。