樟葉越桔懸浮培養(yǎng)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的LC?MS 分析

武波曉 付 羚 李楚然 劉 云 唐軍榮 楊曉琴 馬煥成 趙 平,3

（1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650233；2.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650233；3.云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650233）

樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）野生植物，主要分布于四川、貴州、云南和西藏等地，其全株具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效[1?2]。該植物的幼嫩葉芽富含氨基酸等多種營養(yǎng)成分，經(jīng)殺青、蒸制、干燥后所得的產(chǎn)品在云南彝族民間又稱“雀嘴茶”，據(jù)記載自明朝起一直飲用至今[3?4]。雀嘴茶富含咖啡酰熊果苷類物質(zhì)[5?7]，其主要成分6′?O?咖啡酰熊果苷（6′?O?caffeoylarbutin）對黑色素生成的抑制效果和安全性均優(yōu)于目前市場主流的美白活性添加劑熊果苷[8]，且具有良好的降血脂活性[9]，表明該類物質(zhì)有望作為熊果苷替代品加以開發(fā)應(yīng)用。隨著近年來市場對雀嘴茶的需求日益增加，樟葉越桔連年遭受破壞性采摘，導(dǎo)致其資源蘊藏量日趨減少。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)開展樟葉越桔活性物質(zhì)的生產(chǎn)等相關(guān)研究，對于該資源的可持續(xù)利用具有重要意義。

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有不受地理環(huán)境、季節(jié)、氣候條件的約束和病蟲害影響，生長周期短，產(chǎn)量高等顯著優(yōu)點，是連續(xù)、穩(wěn)定獲取目標(biāo)代謝物和保護(hù)野生植物資源的有效途徑[10]。近年來，利用該技術(shù)在人參（Panax ginseng）、西洋參（P.quinquefolius）、三七（P.notoginseng）、紫草（Lithospermum erythrorhizon）和紅豆杉（Taxus chinensis）等1 000 余種藥用植物的次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)上開展了許多研究[11]。羅旭璐等[12]、于曉銳等[13]和付羚等[14]先后建立了樟葉越桔的組培苗快繁、扦插和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，尚俊可等[15]和譚亞婷等[16]初步探討了植物生長激素NAA 和IBA 對組培苗熊果苷類成分含量的影響，但細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系是否具有咖啡酰熊果苷類等活性代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力尚不清楚。本試驗采用LC?MS 技術(shù)，對樟葉越桔懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的甲醇提取物進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析，以期為利用該懸浮培養(yǎng)體系闡明咖啡酰熊果苷類等活性物質(zhì)的高產(chǎn)機(jī)制及其進(jìn)一步的生產(chǎn)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 實驗材料

以樟葉越桔新鮮幼嫩葉片為外植體，在木本植物培養(yǎng)基（WPM）+2.0 mg/L 6?芐氨基腺嘌呤（6?BA）+0.05% mg/L 萘乙酸（NAA）+2.0 mg/L 2,4?二氯苯氧乙酸（2,4?D）+30%蔗糖條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，所得愈傷組織在WPM+2.0 mg/L玉米素（ZT）+0.4 mg/L NAA+30%蔗糖條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到的蓬松愈傷組織在WPM 3/5 有機(jī)+2.0 mg/L ZT+0.4 mg/L NAA+30%蔗糖條件下培養(yǎng)14 d 后的樟葉越桔懸浮細(xì)胞[14]供本研究后續(xù)使用。

1.1.2 儀器與試劑

CBM30A UPLC 超高效液相色譜（島津科學(xué)儀器股份有限公司，日本），4500 QTRAP 串聯(lián)質(zhì)譜（賽默飛應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國），D11961 超純水機(jī)（Thermo 公司，美國），MM 400 研磨儀（弗爾德集團(tuán)公司，德國），CF16RXII 臺式高速冷凍離心機(jī)（日立公司，日本），BCD?215TD GA 冰箱（青島海爾股份有限公司，中國），QL?901 渦旋振蕩器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，中國），0.22 μm 微孔濾膜（合肥新恩源生物技術(shù)有限公司，中國），色譜純乙腈（上海拜力生物科技有限公司，中國），色譜純甲醇（上?？蒲派锟萍加邢薰?，中國），色譜純乙醇（上海科雅生物科技有限公司，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樟葉越桔懸浮細(xì)胞甲醇提取物的制備

取培養(yǎng)14 d 的適量樟葉越桔懸浮細(xì)胞，用180 目篩濾除培養(yǎng)液后進(jìn)行真空冷凍干燥，采用研磨儀在30 Hz 條件下研磨成均勻粉末備用。精確稱取100 mg 粉末樣品，置于1 mL 70%甲醇水溶液的樣品瓶中，在渦旋振蕩器上充分渦旋提取3 次后，在4 ℃、13 000 r/min 條件下高速離 心10 min，所得上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾后供LC?MS 分析用。

1.2.2 LC?MS 分析條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A 為含0.04% 乙酸的超純水，B 為含0.04%乙酸的乙腈；梯度洗脫程序為5% B～95%B（0～11 min），95% B（11.1～12 min），5% B（12.1～15 min）；流速為0.4 mL/min。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件：正負(fù)離子電噴霧離子源（ESI），溫度為550 ℃，質(zhì)譜電壓為5 500 V，簾氣（CUR）為25 psi，掃描范圍為70～1 000m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MassBank（http://www.massbank.jp/ ）、KNAPSAcK（http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK/ ）、HMDB（http://www.hmdb.ca/）、MoTo DB（http://www.ab.wur.nl/moto/）和METLIN（http://metlin.scripps.edu/index.php）等已有的公共質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫[17?18]對代謝物進(jìn)行分析鑒定。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）分析方法[19]，排除非目標(biāo)離子干擾后對所有代謝物質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分及積分校正，并采用面積歸一法計算出各代謝物的相對含量。

2 結(jié)果與分析

從樟葉越桔懸浮培養(yǎng)細(xì)胞甲醇提取物中共分析鑒定出208 個化合物，包括酚酸類、黃酮類、萜類、原花青素類、苯丙素類和生物堿類等。其中，以酚酸和黃酮類為主，化合物數(shù)量分別為79 個和70 個，相對含量分別占全部化合物的33.244%和23.167%。萜類、原花青素類、苯丙素類、生物堿類和其他類化合物的數(shù)量分別為15、12、12、11 個和9 個，它們的相對含量分別為19.786%、15.138%、1.401%、2.200% 和5.064%（圖1）。相對含量大于1%的化合物共有26 個，包括7 個酚苷、4 個三萜、4 個原花青素、3 個酚酸、2 個二氫黃酮苷、2 個胺類，以及黃酮苷、黃酮醇苷、環(huán)烯醚萜苷和黃烷3-醇各1 個，它們的相對含量總和為72.180%（表1）。

圖1 懸浮細(xì)胞甲醇提取物代謝物的分類和相對含量Fig.1 Classification and relative contents of metabolites in methanol extract of cell suspension culture

2.1 酚酸類化合物分析

由表1 可知，酚酸類化合物是樟葉越桔懸浮細(xì)胞中占比最大的一類物質(zhì)，由34 個酚苷和45 個其他酚酸類衍生物構(gòu)成，其相對含量分別為22.072%和11.172%。

表1 樟葉越桔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中的主要代謝產(chǎn)物Table 1 The main secondary metabolites in cell suspension culture of V.dunalianum

酚苷類化合物包含有樟葉越桔苷B（3.705%）、芥子酸吡喃葡萄糖酯（2.624%）、芥子酸4?O?葡萄糖苷（2.152%）、2,5?二羥基苯甲酸?O?葡萄糖苷（1.935%）、樟葉越桔苷A（1.832%）、樟葉越桔苷C（1.263%）、阿魏酸4?O?葡萄糖苷（1.254%）、1?O?[(E)?對香豆酰]?β?D?吡喃葡萄糖（0.996%）、5?(2?羥乙基)?2?O?葡萄糖基苯 酚（0.915% ）、3,4,5?三甲氧基苯基 1?O?D?葡萄糖吡喃苷（0.838%）、紫丁香苷（0.595%）、夾竹桃苷（0.497%）、對香豆酸?O?葡萄糖苷（0.489%）、水楊酸?O?葡萄糖苷（0.460%）、6′?O?咖啡酰熊果苷（0.444%）、葡萄糖氧基苯甲酸（0.429%）、6?O?乙酰熊果苷（0.313%）、丁香酸?O?葡萄糖苷（0.277%）、6?O?反式咖啡酰?β?D?吡喃葡萄糖（0.186%）、β?D?呋喃果糖基?α?D?(3?芥子酰基) 葡萄糖苷（0.183%）、異水楊酸?O?葡萄糖苷（0.169%）、1′?O?香草酰?β?D?葡萄糖苷（0.087%）、順?對?肉桂酸 4?O?葡萄糖苷（0.076%）、3?O?對香豆酰莽草酸?O?葡萄糖苷（0.071%）、3?O?沒食子?；?β?D?葡萄糖（0.061%）、葡萄糖沒食子鞣苷（0.060%）、3?羥基?4?異丙基苯甲基乙醇?3?葡萄糖苷（0.036%）、阿魏酸?白藜蘆醇苷（0.026%）、迷迭香酸葡萄糖苷（0.024%）、6?O?沒食子酸?β?D?吡喃葡萄糖苷（0.023%）、3?O?對香豆酰奎寧酸?O?葡萄糖苷（0.018%）、香草酸葡萄糖苷（0.017%）、水楊苷（0.011%）和3?異戊烯基?4?O?β?D?吡喃葡萄糖?4?羥基苯甲酸（0.006%）。

45 個其他酚酸類衍生物包含有1,3?二阿魏酰甘油酯（2.682%）、三羥基肉桂?？鼘幩幔?.636%）、香蘭素（1.838%）、鄰苯二甲酸酐（0.915%）、4?羥基苯甲醛（0.486%）、原兒茶酸（0.463%）、阿魏酸（0.288%）、對羥基苯甲酸（0.202%）、丁香醛（0.199%）、阿魏酰芥子酰酒石酸（0.156%）、阿魏酰阿魏酰酒石酸（0.131%）、短葉蘇木酚酸（0.125%）、對香豆酰阿魏酰酒石酸（0.124%）、龍膽酸（0.100%）、4?羥基?3?甲氧基肉桂醛（0.081%）、咖啡酸（0.079%）、對香豆酸甲酯（0.074%）、對香豆?？Х弱＞剖幔?.067%）、芥子酰?p?香豆酰酒石酸（0.055%）、沒食子酸（0.047%）、對香豆酸（0.047%）、綠原酸（0.046%）、4?甲氧基肉桂醛（0.037%）、松柏醛（0.029%）、香草酸（0.022%）、綠原酸甲酯（0.020%）、芥子酸（0.019%）、反式?4?羥基?3?甲氧基肉桂酸（0.019%）、芥子醇（0.019%）、丁香酸（0.018%）、對?香豆醇（0.017%）、咖啡醛（0.016%）、對氨基苯甲酸（0.015%）、1?O?對香豆酰甘油（0.015%）、阿魏酰蘋果酸（0.014%）、反式對羥基肉桂酸甲酯（0.012%）、氫化肉桂酸（0.011%）、苯甲酸（0.009%）、1?O?阿魏酰?3?O?對香豆酰甘油（0.008%）、兒茶酚（0.008%）、肉桂酸乙酯（0.007%）、3,4?二甲氧基肉桂酸（0.006%）、香豆醛（0.004%）、二對香豆酰酒石酸（0.004%）和3?氨基水楊酸（0.003%）。

其中，10 個化合物的相對含量大于1%，分別為樟葉越桔苷B、1,3?二阿魏酰甘油酯、三羥基肉桂酰奎寧酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯、芥子酸4?O?葡萄糖苷、2,5?二羥基苯甲酸?O?葡萄糖苷、香蘭素、樟葉越桔苷A、樟葉越桔苷C 和阿魏酸4?O?葡萄糖苷（表1）。此外，樟葉越桔苷A?C、6′?O?咖啡酰熊果苷、6?O?乙酰熊果苷、6′?O?反式咖啡酰吡喃葡萄糖、阿魏酸4?O?葡萄糖苷、咖啡酸和綠原酸等9 個化合物曾從雀嘴茶中分離得到[5]。

2.2 黃酮類化合物分析

由表1 可知，黃酮類化合物為樟葉越桔懸浮細(xì)胞中的第二大類代謝產(chǎn)物，包含58 個黃酮苷類和12 個其他黃酮類化合物，相對含量分別為13.765%和9.402%。其中，黃酮苷類又可分為黃酮醇苷36 個，黃酮碳苷8 個、黃酮苷6 個、二氫黃酮苷5 個、二氫黃酮碳苷1 個、異黃酮苷1 個和查耳酮苷1 個。在所有黃酮類化合物中，相對含量大于1%的化合物有5 個，其中黃烷3?醇類化合物—兒茶素的含量最高，為8.030%；其次分別為黃酮苷—苜蓿素?O?葡萄糖二酸（2.392%）、二氫黃酮苷—柚皮素?4′?O?葡萄糖苷（1.966%）和櫻桃苷（1.022%）、和黃酮醇苷—槲皮素?3?O?β?D?半乳糖苷（1.105%）。

黃酮醇苷類化合物分別鑒定為槲皮素?3?O?β?D?半乳糖苷、異金絲桃苷（0.715%）、繡線菊苷（0.713%）、6?羥基山柰酚?7?O?葡萄糖苷（0.704%）、異鼠李素?3?O?葡萄糖苷（0.595%）、異鼠李素?7?O?葡萄糖苷（0.585%）、槲皮素?3?O?β?D?葡萄糖苷（0.525%）、槲皮素?7?O?葡萄糖苷（0.420%）、番石榴苷（0.217%）、槲皮素?3?O?β?D?吡喃木糖苷（0.110%）、槲皮素?3?O?洋槐糖苷（0.073%）、槲皮素?3?O?蕓香糖苷（0.060%）、山柰酚?7?O?葡萄糖苷（0.055%）、山柰酚?3?O?洋槐糖苷（0.039%）、山柰酚?3?O?蕓香糖苷（0.036%）、槲皮素?3?O?（6″?O?丙二酰）?半乳糖苷（0.035%）、檞皮素?3?阿拉伯糖基葡萄糖苷（0.027%）、6?羥基山柰酚?7,6?O?二葡萄糖苷（0.027%）、槲皮素?O?阿魏酰戊糖苷（0.026%）、槲皮素?3?O?桑布雙糖苷（0.026%）、異鼠李素?O?己糖?O?己糖（0.026%）、槲皮素?3?O?β?D?木糖?（1→2）?β?D?半乳糖苷（0.025%）、山柰酚?3?O?（6″?丙二酰）?葡萄糖 苷（0.024%）、山柰酚?3?O?β?D?槐糖苷（0.021% ）、槲皮素?O?蕓香苷?己糖（0.021%）、槲皮素?3,7?O?β?D?二葡萄糖苷（0.021% ）、楊梅素?3?O? 半乳糖苷（0.019%）、檸檬素?3?鼠李糖苷（0.019%）、棉黃素?3?葡萄糖苷（0.018%）、山柰酚?3?O?葡萄糖苷?7?O?鼠李糖苷（0.009%）、楊梅素?3?O?阿拉伯糖苷（0.008% ）、楊梅苷（0.007%）、槲皮素?O?戊糖苷?O?己糖苷?O?己糖苷（0.007%）、異鼠李素?3?O?阿拉伯糖苷（0.006%）、6?羥基山柰酚?3,7,6?O?三葡萄糖苷（0.004%）和山柰酚?3?O?阿拉伯糖苷（0.002%）。

8 個黃酮碳苷分別為芹菜素?6?C?葡萄糖苷（0.089%）、芹菜素?6?C?2?葡萄糖醛酸基木糖苷（0.072%）、芹菜素?8?C?葡萄糖苷（0.029%）、金雀異黃素?8?C?葡萄糖苷（0.027%）、5,7,4'?三羥基?8?C?β?D?葡萄糖黃酮（0.024%）、8?C?己糖苷?木犀草素?O?己糖苷（0.013%）、芹菜素?6,8?C?二葡萄糖苷（0.009%）、木犀草素?6?C?葡萄糖苷（0.004%）。

6 個黃酮苷分別為苜蓿素?O?葡萄糖二酸、香葉木素?7?O?半乳糖苷（0.484%）、木犀草素?7?O?葡萄糖苷（0.031%）、芹菜素 7?O?葡萄糖苷（0.024%）、木犀草素?7?O?蕓香糖苷（0.013%）和苜蓿素?O?蕓香糖苷（0.002%）。5 個二氫黃酮苷分別為柚皮素?4′?O?葡萄糖苷、櫻桃苷、橙皮素5?O?葡萄糖苷（0.614%）、橙皮素?7?O?葡萄糖苷（0.043%）和喬松素?7?O?β?D?葡萄糖苷（0.014%）。1 個二氫黃酮碳苷為異柚葡萄糖苷（0.015%），1 個異黃酮苷為2'?羥基?5?甲氧基?染料木素?O?鼠李糖苷?葡萄糖苷（0.015%）和1 個查耳酮苷為根皮苷（0.533%）。

其他黃酮類衍生物包括5 個黃烷3?醇[兒茶素、表兒茶素（0.386%）、沒食子兒茶素（0.028%）、表兒茶素沒食子酸酯（0.008%）和兒茶素沒食子酸酯（0.008%）]、2 個二氫黃酮醇[花旗松素（0.621%）和短葉松素（0.010%）、2 個黃酮醇[3,4?二氧?甲基槲皮素（0.106%）和楊梅素（0.006%）]、2 個二氫黃酮[ 圣草酚（0.084%）和柚皮素（0.009%）、和1 個查耳酮[4,2′,4′,6′?四羥基查耳酮（0.106%）]。

2.3 萜類化合物分析

由表1 可知，從樟葉越桔懸浮細(xì)胞中共分析鑒定出15 個萜類化合物，包括8 個三萜、2 個二萜和5 個環(huán)烯醚萜苷。三萜分別為馬斯里酸（7.503%）、2?羥基齊墩果酸（7.318%）、熊果酸（1.359%）、24?羥基齊墩果酸（1.261%）、咖啡酰山楂酸（0.565%）、2,3?二羥基5(6)，12(13)?二烯熊果酸（0.139%）、3?O?(2?O?乙?；?β?D?吡喃葡萄糖基)齊墩果酸（0.051%）和甲氧基熊果酸（0.013%）。二萜分別為2,6?二甲基?7?辛 烯?2,3,6?三 醇（0.261% ）和ailantinol E（0.066%）；環(huán)烯醚萜苷分別為水晶蘭苷（1.019%）、水晶蘭苷甲酯（0.094%）、二氫水晶蘭苷甲酯（0.074%）、3′?O?D?葡萄糖酰龍膽苦苷（0.033%）和雞矢藤次苷（0.030%），其中水晶蘭苷和雞矢藤次苷曾從雀嘴茶中分離得到[5]。相對含量大于1% 的萜類化合物為馬斯里酸、2?羥基齊墩果酸、熊果酸、24?羥基齊墩果酸和水晶蘭苷。

2.4 原花青素類、苯丙素類、生物堿類和其他類化合物分析

由表1 可知，從樟葉越桔懸浮細(xì)胞中共分析鑒定出12 個原花青素、12 個苯丙素、11 個生物堿和9 個其他類型化合物。原花青素類包括原花青素A1（1.198%）、A2（8.655%）、B1（0.725%）、B2（0.499%）、B3（0.411%）、B4（1.663%）、C1（0.397%）和C2（0.101%），肉桂單寧A2（0.006%）、B2（0.059%）和D1（1.264%），以及表兒茶素?表阿夫兒茶精（0.160%）。其中，4 個化合物的相對含量大于1%。

苯丙素類化合物包含有8 個木脂素，丁香樹脂酚?己糖（0.546%）、松脂醇二葡萄糖苷（0.405%）、（0.131%）、松脂醇單葡萄糖苷（0.046%）、丁香樹脂酚（0.034%）、1?羥基松脂素單葡萄糖苷（0.025%）、丁香樹脂醇?4′?O?β?D?單葡萄糖苷（0.012%）和1?羥基松脂素二葡萄糖苷（0.009%）；4 個香豆素，異莨菪亭（0.093%）、茵芋苷（0.052%）、秦皮甲素（0.038%）和東莨菪內(nèi)脂（0.010%）。

生物堿類衍生物包含有N?苯亞甲基異甲胺（0.684%）、6?脫氧蕎麥堿（0.447%）、甜菜堿（0.422%）、煙酸甲酯（0.278%）、L?莨菪堿（0.227%）、吲哚?3?甲醛（0.082%）、3?羥丙基棕櫚酸酯葡萄糖胺（0.028%）、椰油酰胺丙基甜菜堿（0.016%）、氨基嘌呤（0.009%）、2?（β?D?吡喃葡萄糖基氧基）?4?羥基苯乙腈（0.004%）和吲哚（0.003%）。

其他類化合物包含有N?乙酰基腐胺（2.351%）、胍丁胺（2.154%）、4?甲基?5?噻唑乙醇（0.330%）、虎杖苷（0.102%）、N?乙酰?D?半乳糖胺（0.049%）、tababiphenyl C（0.039%）、芐基?β?D?吡喃葡萄糖基(1?6)?β?D?吡喃葡萄糖苷（0.021%）、N?乙酰葡萄糖胺 1?磷酸（0.016%）和白藜蘆醇?O?二葡萄糖苷（0.004%）。

3 結(jié)論與討論

采用LC?MS 聯(lián)用技術(shù)從樟葉越桔懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的甲醇提取物中共分析鑒定出208 種次生代謝產(chǎn)物，其中包括酚酸類79 個、黃酮類70 個、萜類15 個、原花青素類12 個、苯丙素類12 個、生物堿類11 個和其他類衍生物9 個，相對含量分別 為33.244%、23.167%、19.786%、15.138%、1.401%、2.200%和5.064%。酚酸類化合物中包含酚苷34 個和其他酚酸衍生物45 個，相對含量分別為22.072% 和11.172%，黃酮類化合物中包含黃酮苷類58 個和其他黃酮類衍生物12 個，相對含量分別為13.765% 和9.402%。相對含量大于1%的化合物共有26 個，相對含量總計為72.180%，為樟葉越桔懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的主要代謝產(chǎn)物。其中，含量最高的化合物為原花青素A2（8.655%），其次為兒茶素（8.030%）、馬斯里酸（7.503%）、2?羥基齊墩果酸（7.318%）和樟葉越桔苷B（3.705%）。

大量研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類、黃酮類、原花青素類、萜類等代謝產(chǎn)物具有顯著的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和降血糖等多種生理活性[20?27]，表明樟葉越桔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系有望為生產(chǎn)原花青素A2 等活性物質(zhì)提供一條新的途徑。Luo 等[7]的HPLC 定量分析研究發(fā)現(xiàn)，6′?O?咖啡酰熊果苷、綠原酸和熊果苷為樟葉越桔的3 個主要化學(xué)成分，它們在樟葉越桔幼嫩葉片（本研究使用的外植體）中的含量分別為2.952%、0.744%和0.706%，本研究從懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中首次檢測到6′?O?咖啡酰熊果苷（0.444%）和綠原酸（0.046%），與外植體中的含量差異較大，值得進(jìn)一步深入系統(tǒng)地開展懸浮細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)調(diào)控研究。與雀嘴茶相似，酚苷類代謝產(chǎn)物在樟葉越桔懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中最為豐富，其中樟葉越桔苷A?C、6′?O?咖啡酰熊果苷、6?O?乙酰熊果苷、6′?O?反式咖啡酰吡喃葡萄糖、阿魏酸4?O?葡萄糖苷、咖啡酸和綠原酸等化合物曾從雀嘴茶中分離得到[5]。這些酚苷類化合物分子多樣性的存在；同時也提示樟葉越桔及其懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中含有豐富多樣的芳香族?；D(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的基因[28?29]。開展這些轉(zhuǎn)移酶基因的分子生物學(xué)相關(guān)研究，將為進(jìn)一步闡明樟葉越桔中咖啡酰熊果苷類物質(zhì)的高產(chǎn)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。