尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化表達(dá)松材線蟲Bx?apa?2 和Bx?apm?2 基因dsRNA 以及飼喂法介導(dǎo)的RNAi 研究

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是引起松樹萎蔫病的主要元兇，對(duì)世界范圍內(nèi)的松林造成極大的危害[1]。目前，對(duì)該病的防治，主要是針對(duì)其媒介昆蟲天牛（Monochamusspp.）進(jìn)行藥物防治[2]，但是這種方式極易在自然界中產(chǎn)生藥物殘留而造成生態(tài)環(huán)境的次級(jí)危害。RNA 干擾（RNAi），作為一種常用的研究技術(shù)，目前已有轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)雙鏈RNA（dsRNA）并對(duì)其寄主生物進(jìn)行抵抗的報(bào)道，而且這種防御策略不會(huì)造成生態(tài)環(huán)境的破壞，因而具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值[3?4]。在秀麗線蟲的研究中，通過飼喂其表達(dá)靶基因dsRNA的大腸桿菌（Escherichia coli）可以引起秀麗線蟲特定的RNAi 效應(yīng)[5]，即飼喂法介導(dǎo)的RNAi。在松材線蟲中，通過飼喂表達(dá)其靶標(biāo)基因dsRNA 的真菌，同樣也可以使線蟲產(chǎn)生特定的RNAi 效應(yīng)[6]。最近的研究表明，哺乳動(dòng)物胃中的SIDT1 蛋白可以介導(dǎo)食物miRNA 的吸收，進(jìn)而使其在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能[7]。這表明，食源性的核酸分子可能對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生廣泛性的影響。因此，飼喂法介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)無論是在動(dòng)植物疾病防控還是人類醫(yī)療中均有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

銜接蛋白（AP）是一種由多亞基組成的異四聚體蛋白復(fù)合物，其介導(dǎo)參與細(xì)胞膜上網(wǎng)格蛋白的作用以及識(shí)別跨膜蛋白分子胞質(zhì)尾區(qū)的分選信號(hào)[8]。迄今為止，在哺乳動(dòng)物和擬南芥中發(fā)現(xiàn)了5種AP（1?5）蛋白，而在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）以及黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中僅發(fā)現(xiàn)3 種AP 蛋白（AP1?3）。物種間各種AP蛋白的組成基本相同，均是由2 個(gè)大亞基，1 個(gè)中亞基和1 個(gè)小亞基組成的異四聚體結(jié)構(gòu)[9?10]。在這之中，AP2 主要與網(wǎng)格蛋白相互作用，負(fù)責(zé)將其組裝到質(zhì)膜上。AP2 蛋白的β 亞基上鉸鏈及相關(guān)結(jié)構(gòu)域可結(jié)合網(wǎng)格蛋白，而其他α 和β 亞基的區(qū)域則負(fù)責(zé)募集動(dòng)力蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。秀麗隱桿線蟲中，apa?2基因編碼了AP2?α 大亞基。在果蠅中，AP2?α 大亞基無效等位基因可產(chǎn)生神經(jīng)肌肉接頭處沒有突出小泡，破壞細(xì)胞的內(nèi)吞作用并導(dǎo)致胚胎的死亡[11]。在秀麗隱桿線蟲中，apm?2基因編碼了AP2?μ 中亞基，功能上可與受體上的酪氨酸富含區(qū)域相結(jié)合，促進(jìn)受體與網(wǎng)格蛋白包被的相互作用，并識(shí)別受體胞質(zhì)尾區(qū)“YXXφ”分選信號(hào)，調(diào)控受體與配體的內(nèi)吞過程[12?13]。降低該基因的表達(dá)可導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲胚胎致死和幼蟲發(fā)育停滯，對(duì)維持正常神經(jīng)元的功能是必需的[14]。另有研究指出，無效突變AP2?α 或AP2?μ 的秀麗隱桿線蟲是可存活的，主要表現(xiàn)出30% 左右的突觸囊泡數(shù)量下降；但α?μ2 同時(shí)突變則會(huì)造成突觸囊泡數(shù)量70% 的下降，并導(dǎo)致明顯的致死現(xiàn)象[10]?？傊珹P2 在執(zhí)行有關(guān)蛋白分選和轉(zhuǎn)運(yùn)、維持正常神經(jīng)元的功能等過程中起到非常關(guān)鍵的載體作用。松材線蟲作為一種入侵物種是目前松林疫病防控的重點(diǎn)，以編碼松材線蟲AP2?α 和AP2?μ 亞基的基因?yàn)閷?duì)象，可以作為重要的分子靶標(biāo)進(jìn)行研究，為未來應(yīng)用RNAi 進(jìn)行松材線蟲病的防控提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用到的松材線蟲，取自浙江省嵊泗縣，并在實(shí)驗(yàn)室條件下傳代培養(yǎng)。研究的供試真菌為尖孢鐮刀菌甘藍(lán)種（F.oxysporumf.sp.conglutinanswild-type Foc?A8），用于構(gòu)建真菌表達(dá)載體為pDH?RH 和pKOV21。以上材料均獲于北京師范大學(xué)。

1.2 RNA 提取及cDNA 第1 鏈的合成

為獲得高質(zhì)量的松材線蟲RNA，本研究采用Trizol 結(jié)合RNA 提取試劑盒（NucleoSpin RNA II Kit，德國）的方法[15]，為后續(xù)的靶基因片段的擴(kuò)增以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q?PCR）做準(zhǔn)備。RNA提取后，按照PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit（寶生物）說明進(jìn)行cDNA 第1 鏈的合成。

1.3 目的片段的純化及載體構(gòu)建

根據(jù)松材線蟲Bx?apa?2基因（Wormbase Parasite 數(shù)據(jù)庫：BXY_1519000）和Bx?apm?2基因（Wormbase Parasite 數(shù)據(jù)庫：BXY_1516200.1）分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增靶基因片段，用以構(gòu)建dsRNA 表達(dá)載體。以PCH?sGFP 表達(dá)載體序列為參考設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增綠色熒光蛋白（GFP）基因片段，用以構(gòu)建dsRNA 表達(dá)無關(guān)干擾載體。引物設(shè)計(jì)信息如表1 所示，以上一步合成的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR體系為50 μL，包括：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus）10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）4 μL，引物對(duì)10～15 pmol，cDNA 1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL)0.5 μL。擴(kuò)增條件為：94 °C 10 min，循環(huán)35 個(gè)（94 °C 30 s，退火溫度15 s，72°C 30 s），72 °C 7 min。擴(kuò)增后的片段采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（APx?GX?50，愛思進(jìn)）進(jìn)行純化，之后片段連入pJET1.2 載體（Rapid DNA ligation Kit，美國賽默飛），并經(jīng)克隆測序后驗(yàn)證正確。

表1 用以載體構(gòu)建、檢測、Q?PCR 引物信息Table 1 Primers used in this study for vector construction,detection and Q?PCR

將目的片段連入pDH?RH 載體的過程，主要采用雙酶切并經(jīng)T4 DNA 連接酶的方法進(jìn)行，同Wang 等所述[6]。為實(shí)現(xiàn)同一Foc?A8 菌株中轉(zhuǎn)入不同靶基因片段，根據(jù)pKOV21 載體序列，設(shè)計(jì)一段引物擴(kuò)增包括neo基因啟動(dòng)子和終止子在內(nèi)的片段，并在引物兩端引入KpnI 酶切位點(diǎn)。原載體pDH?RH 經(jīng)KpnI 單酶切去除潮霉素抗性基因（hph），并經(jīng)蝦堿性磷酸酶（rSAP）處理后，與neo擴(kuò)增片段相連，形成具有新霉素抗性的pDN?RH 載體。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化及陽性真菌轉(zhuǎn)化體的鑒定

構(gòu)建好的連有目的片段的pDH?RH 和pDN?RH 質(zhì)粒載體，通過電擊轉(zhuǎn)化AGL?1 農(nóng)桿菌感受態(tài)，并介導(dǎo)尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化過程，操作方法同Wang 等[6]。篩選出潛在含有目的片段的Foc?A8真菌轉(zhuǎn)化體。待選真菌轉(zhuǎn)化體采用CTAB 法提取基因組DNA，并使用PHD?up 引物對(duì)和PHD?down引物對(duì)同時(shí)檢測上下游插入片段。PCR 鑒定完畢后，為了確定T?DNA 的隨機(jī)插入及在基因組中的拷貝數(shù)，以目標(biāo)片段作為探針，使用洋地黃毒苷標(biāo)記和檢測系統(tǒng)進(jìn)行Southern 雜交（High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，羅氏）驗(yàn)證。

1.5 松材線蟲飼喂法介導(dǎo)的RNAi及Q-PCR表達(dá)驗(yàn)證

將經(jīng)過鑒定的Fox?A8 真菌轉(zhuǎn)化體接種到PDA 平板上，待菌絲生長至邊緣約1 cm 時(shí)，隨機(jī)將100 條線蟲接種到真菌墊上，分別經(jīng)過20、30、40 d 的生長繁殖后，用無菌水將線蟲清洗出來，進(jìn)行驗(yàn)證。按1.2 中所述提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。以松材線蟲Bx?ef1a基因作為內(nèi)參，通過2?ΔΔCT方法計(jì)算靶基因在經(jīng)飼喂法介導(dǎo)的RNAi 處理后的相對(duì)表達(dá)量的差異。

1.6 松材線蟲形態(tài)學(xué)參數(shù)的測定

經(jīng)飼喂法介導(dǎo)的RNAi 干擾前后的松材線蟲，使用TAF 固定液（每100 mL 含有：40%甲醛7 mL，三乙醇胺2 mL，蒸餾水91 mL）進(jìn)行固定。固定好的線蟲置于玻片上，立即于顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。為了衡量線蟲在經(jīng)過RNAi 處理后的身體形態(tài)上的變化，本研究主要測量松材線蟲成蟲的體長和最大體寬等指標(biāo)，并計(jì)算 a值：體長/最大體寬[16]。通常情況下，為描述一個(gè)松材線蟲群體，雌雄至少各測量25 條，本研究為了結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)不同處理組的松材線蟲，隨機(jī)取雌蟲和雄蟲成蟲各30 條進(jìn)行測量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 軟件分析各組實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以P0.05 為顯著水平，以P0.01 為極顯著水平。統(tǒng)計(jì)時(shí)，多組數(shù)據(jù)之間比較，在滿足方差齊性的前提下，進(jìn)行單因素方差分析（One?way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，再進(jìn)行Duncan 兩兩比較。若方差不齊，則采用Kruskal?Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)，之后再進(jìn)行Mann?Whitney U 兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建

對(duì)構(gòu)建好的載體及空載體分別用引物對(duì)PHD?A（A）和PHD?P（P）進(jìn)行上游和下游PCR 驗(yàn)證（圖1）。結(jié)果顯示：Bx?apa?2基因上游檢測片段p?apa2: A 長度為981 bp，下游檢測片段長度p?apa2: P 為1 221 bp；Bx?apm?2基因上游檢測片段p?apm2: A 長度為1 275 bp，下游檢測片段長度p?apm2: P 為1 515 bp；GFP 基因上游檢測片段p?GFP: A 長度為 934 bp，下游檢測片段長度p?GFP: P 長度為 1 174 bp；對(duì)照空載體上游檢測片段p?vector: A 長度為560 bp，下游檢測片段長度p?vector: P 為800 bp。用于載體構(gòu)建的擴(kuò)增片段均經(jīng)測序后驗(yàn)證正確。

圖1 載體構(gòu)建上下游片段PCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 PCR results of anterior and posterior fragments for vectors' construction

2.2 真菌轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)入驗(yàn)證及表達(dá)驗(yàn)證

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化過程，本研究獲得了分別轉(zhuǎn)入GFP、Bx?apa?2和Bx?apm?2基因上下游片段并具有潮霉素抗性真菌轉(zhuǎn)化體以及同時(shí)轉(zhuǎn)入Bx?apa?2和Bx?apm?2基因具有新霉素抗性的真菌轉(zhuǎn)化體（圖2）。對(duì)這些真菌轉(zhuǎn)化體進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示在候選真菌轉(zhuǎn)化體基因組中均有效轉(zhuǎn)入了目標(biāo)片段，（圖3a）。進(jìn)一步通過Southern blot 顯示，候選真菌轉(zhuǎn)化體是以隨機(jī)單拷貝的方式插入到基因組中，在Bx?apm?2和Bx?apm?2基因片段同時(shí)轉(zhuǎn)入的真菌轉(zhuǎn)化體中顯示出了兩個(gè)靶標(biāo)轉(zhuǎn)入的情形（圖3b）。為了驗(yàn)證這些插入片段能正常在真菌轉(zhuǎn)化體中轉(zhuǎn)錄，通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT?PCR），使用d?apa?2、d?apm?2以及d?GFP 引物分別進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入片段能正常的轉(zhuǎn)錄（圖3c）。

圖2 轉(zhuǎn)入不同目標(biāo)片段的尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化體Fig.2 F.oxysporum transformants with different target fragments

圖3 尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化體目標(biāo)片段驗(yàn)證Fig.3 Validation of target fragments of F.oxysporum

2.3 松材線蟲靶基因飼喂法介導(dǎo)的RNAi qPCR 結(jié)果

將松材線蟲接種到相應(yīng)的真菌轉(zhuǎn)化體上進(jìn)行飼喂法介導(dǎo)的RNAi，RT?qPCR 檢測靶基因的相對(duì)表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)干擾30 d 時(shí)，Bx?apa?2基因（圖4a）的表達(dá)量約為無關(guān)對(duì)照組dsGFP 表達(dá)量的51%（P0.05）；而干擾Bx?apm?2基因（圖4b）時(shí)，在20 d 時(shí)即表現(xiàn)出明顯的靶基因水平降低（約正常值的65%，P0.05），此后，隨干擾時(shí)間的增長，表達(dá)量繼續(xù)降低。這表明，松材線蟲Bx?apa?2基因和Bx?apm?2基因經(jīng)過飼喂法介導(dǎo)的RNAi 后顯著降低表達(dá)（P0.05）。通過飼喂線蟲同時(shí)含有表達(dá)兩個(gè)基因片段dsRNA的真菌，靶標(biāo)基因Bx?apa?2基因和Bx?apm?2基因的表達(dá)量均顯著性下降，分別下調(diào)了47%和80%（圖4c）。

圖4 松材線蟲Bx-apa-2 和Bx-apm-2 基因飼喂法介導(dǎo)的RNAi 基因表達(dá)變化8722;2 基因飼喂法介導(dǎo)的RNAi 基因表達(dá)變化Fig.4 Relative expression changes of Bx?apa?2 and Bx?apm?2 genes after feeding mediated RNAi

2.4 松材線蟲Bx?apa?2 基因和Bx?apm?2 基因RNAi 表型

松材線蟲Bx?apa?2基因和Bx?apm?2基因RNAi 后，各組線蟲的基本形態(tài)如圖5 所示。通過體尺測量，比較非靶標(biāo)對(duì)照線蟲，體長和最大體寬均極顯著減?。≒0.01,圖6a，b），較非靶標(biāo)對(duì)照，干擾Bx?apa?2基因，線蟲“a”值沒有明顯差異，干擾Bx?apm?2基因，雌性線蟲“a”值與對(duì)照沒有明顯差異。說明分別飼喂法介導(dǎo)的RNAiBx?apa?2和Bx?apm?2基因，線蟲主要是變得更細(xì)小，即“Small”表型；而在干擾Bx?apm?2基因的雄性個(gè)體以及同時(shí)干擾Bx?apa?2和Bx?apm?2基因的線蟲內(nèi)，其體長和體寬進(jìn)一步縮短，“a”值極顯著減小（P0.01），說明雙干擾的線蟲有明顯的“Dumpy”短粗表型。

圖5 松材線蟲Bx?apa?2 和Bx?apm?2 基因 RNAi 表型Fig.5 Phenotypes of B.xylophilus after Bx?apa?2 and Bx?apm?2 RNAi

圖6 松材線蟲Bx?apa?2 和Bx?apm?2 基因 RNAi 主要的形態(tài)指標(biāo)Fig.6 The main morphological parameters of B.xylophilus after Bx?apa?2 and Bx?apm?2 RNAi

3 結(jié)論與討論

飼喂法介導(dǎo)的RNAi 作為一項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用，其核心是在宿主內(nèi)表達(dá)寄主靶基因dsRNA，寄主通過取食或侵害宿主，從而產(chǎn)生影響寄主生物體相關(guān)基因的作用。這種RNAi 機(jī)制最早的發(fā)現(xiàn)是在模式生物C.elegans中[17]。利用這種機(jī)理，目前已經(jīng)有研究報(bào)道在某些植物病蟲害疫病防治上得到應(yīng)用，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[18]、煙草（Nicotiana tabacum）[19]、番茄（Lycopersicon esculentum）[20]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[21]等。通過本研究，發(fā)現(xiàn)松材線蟲通過取食轉(zhuǎn)入表達(dá)松材線蟲Bx?apa?2基因和Bx?apm?2基因靶基因dsRNA 的尖孢鐮刀菌菌絲，在40 d 范圍內(nèi)可以引起比較明顯的RNAi 效應(yīng)。因此本研究進(jìn)一步證明飼喂法介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)在線蟲等病蟲害的寄主防御上，以及后基因組功能分析上均具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

銜接蛋白是大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞以及在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸過程中起關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì)，這類蛋白負(fù)責(zé)識(shí)別膜受體，指導(dǎo)貨物分子參與囊泡的形成，同時(shí)網(wǎng)格蛋白輕鏈對(duì)網(wǎng)格蛋白被膜的柔韌性具有重要作用，AP2 通過調(diào)節(jié)網(wǎng)格蛋白被膜的剛度，促進(jìn)了被膜囊形成過程中與貨物分子的有效隔離[22]。研究指出，銜接蛋白作為網(wǎng)格蛋白的適配器，協(xié)調(diào)形成包被的囊泡，用于細(xì)胞器之間的物質(zhì)運(yùn)輸。在這個(gè)過程中，AP1 與富含磷脂酰肌醇4?磷酸的膜結(jié)合，而AP2 與質(zhì)膜的磷脂酰肌醇4,5?二磷酸結(jié)合。膜蛋白、貨物蛋白和網(wǎng)格蛋白均能促進(jìn)AP 蛋白的活化[23]。由此可見，AP2蛋白在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白分選和運(yùn)輸過程中蛋白質(zhì)間的相互作用這一相對(duì)復(fù)雜的調(diào)控過程中起到非常重要的作用。

在組成上，物種間AP 蛋白雖有不同，但差異不大[24]。AP2 蛋白相關(guān)亞基，在各物種中均由單基因編碼，松材線蟲的與之類似。在果蠅中，AP2?α 的功能缺失可導(dǎo)致成蟲運(yùn)動(dòng)機(jī)能的減退[11]。C.elegans中，通過體外合成dsRNA 并針對(duì)AP2?α，AP2?μ 相關(guān)基因?qū)嵤㏑NAi 時(shí)，線蟲表現(xiàn)為短粗或突出囊泡的異?，F(xiàn)象[14,25]。然而也有研究指出，AP2?μ 或許是對(duì)突出囊泡的形成可能不是關(guān)鍵的[26]。此外，研究發(fā)現(xiàn)完全突變的Ce?apa?2的線蟲是可以存活的，而只有當(dāng)AP2?α 和AP2?μ都同時(shí)突變，線蟲才會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的表型，這提示當(dāng)AP2?α 缺失時(shí)，β?μ 半復(fù)合體是可以繼續(xù)發(fā)揮AP2 蛋白的部分功能[10]。本研究中干擾AP2?α 編碼基因Bx?apa?2僅會(huì)造成松材線蟲變小，干擾AP2?μ 編碼基因Bx?apm?2基因會(huì)造成雄性個(gè)體較為明顯的“dumpy”現(xiàn)象；而當(dāng)兩個(gè)基因同時(shí)干擾時(shí)，短粗表型更加明顯，這些發(fā)現(xiàn)與C.elegans的部分研究結(jié)果是類似的，證明AP2 蛋白單亞基的缺損可對(duì)線蟲造成不利的影響；而雙亞基的缺失對(duì)其功能的損害是巨大的，會(huì)加劇這種不利的影響。在哺乳動(dòng)物中的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AP?2缺失時(shí)，會(huì)造成小鼠在胚胎發(fā)育早期神經(jīng)發(fā)育的異常[27]。本研究中側(cè)重觀察了松材線蟲的外形表現(xiàn)，因此這一部分的內(nèi)容值得進(jìn)一步探索。

松材線蟲是一種極具破壞性的危險(xiǎn)外來入侵生物，而開發(fā)環(huán)境友好型的松材線蟲防治方式是目前較熱的研究內(nèi)容之一，飼喂法介導(dǎo)的RNAi提供了這種可能性。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，逐漸使用新方法對(duì)這種方法進(jìn)行技術(shù)革新，可為未來進(jìn)行線蟲的基因功能分析，及廣泛應(yīng)用于松材線蟲病害防治等方面提供參考依據(jù)。