花櫚木人工種子膠囊制作及其萌發(fā)效果研究

吳高殷 韋小麗 王 曉 桂 平

（1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

花櫚木（Ormosia henryi）為國家二級重點(diǎn)野生保護(hù)植物，珍貴用材樹種，具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值[1]，其種子種皮堅硬、透水性差和不易吸水[2]，存在繁殖障礙。作者在前期的研究中已建立了花櫚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系[3?4]，獲得的子葉胚可作為人工種胚，可包被在富含營養(yǎng)物質(zhì)的人工胚乳中制作成人工種子，解決花櫚木因種子稀缺和因硬實而導(dǎo)致的萌發(fā)障礙問題。當(dāng)前人工種子的制作方法較多，常見的有單層包埋法[5?6]、雙層包埋法[7]和空心珠法[8]，而密封端法因制作工序繁瑣、生產(chǎn)成本較高鮮有報道[9?10]，但對不同方法制作的人工種子物理性質(zhì)的了解甚少，僅發(fā)現(xiàn)谷睿智[7]采用單層包埋法對添加納米材料人工種皮的保水能力和力學(xué)屬性展開研究，尚未報道哪種制作方法和附加物的人工種子具有更加優(yōu)良的物理性質(zhì)。良好物理性質(zhì)的人工種子可起到防菌、阻止?fàn)I養(yǎng)外滲和保水等作用，為人工種子的萌發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，且方便貯藏、處理、運(yùn)輸和播種[5,11?12]。

因此，本試驗選取3 種人工種子膠囊制作方法和5 種附加物，通過檢測它們的物理性質(zhì)，篩選出物理性質(zhì)良好的人工種子膠囊，進(jìn)一步對花櫚木體細(xì)胞胚進(jìn)行包埋，并探討不同植物生長調(diào)節(jié)劑和低溫貯藏時間對花櫚木人工種子萌發(fā)的影響，為花櫚木人工種子制作、技術(shù)改良和播種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花櫚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)參考Wu 等[3]的方法，其方法獲得的子葉胚作為本試驗的人工種胚。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工種子膠囊制作方法

試驗設(shè)計了3 種人工種子膠囊的制作方法，參考 Patel 等[8]方法并適當(dāng)改進(jìn)。

1）單層包埋法：分別用5 mL，直徑6 mm 的滴管吸取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/L 海藻酸鈉（SA）溶液、0.2 g/L SA 和0.3 g/L SA 后滴入裝有200 mL 0.2 g/L CaCl2溶液的燒杯中絡(luò)合10 min，分別得到人工種子膠囊A1、A2、A3。

2）雙層包埋法：將單層包埋法獲得的人工種子膠囊A1、A2、A3，分別放入0.1、0.2、0.3 g/L SA 溶液后，再滴入2% CaCl2溶液中絡(luò)合10 min，分別得到人工種子膠囊B1、B2、B3。

3）空心珠法：用5 mL，直徑6 mm 的滴管吸取0.15 g/L 羥甲基纖維素CM+0.1 g/L CaCl2混合液或0.3 g/L CM+0.1 g/L CaCl2混合液后，分別滴入0.1、0.2、0.3 g/L SA 溶液中絡(luò)合20 min，分別得到人工種子膠囊C1、C2、C3或D1、D2、D3。

1.2.2 人工種子膠囊物理性質(zhì)的測定

上述12 組人工種子膠囊絡(luò)合結(jié)束后，蒸餾水清洗，濾紙吸干水分，每組人工種子膠囊數(shù)量為60 粒。觀察它們顏色、形狀和測定其物理性質(zhì)（硬度、失水率和復(fù)水率）。

在室溫下（17～22 ℃，空氣濕度80%），MNT?150T 游標(biāo)卡尺（精確到0.01 mm，美耐特，德國）測定人工種子膠囊直徑、長徑，SH?50 硬度計（精確到0.1 N，思為，中國）測定硬度，每組重復(fù)測定3 次。每組包含10 個人工種子膠囊裝入90 mm 培養(yǎng)皿中，每組重復(fù)3 次，分別于0 h（M0h）和24 h（M24h）稱量，24 h 后向每組培養(yǎng)皿中加入50 ml 蒸餾水，進(jìn)行復(fù)水24 h（m24h）并稱重，并按公式（1）～（2）計算24 h 失水率和24 h 復(fù)水指數(shù)。

1.2.3 人工種子膠囊附加物

0.3 g/L SA 溶液中分別加入5 種附加物，每種附加物3 個濃度，分別為活性炭AC[1 g/L（a1）、3 g/L（a2）、7 g/L（a3）]，保水劑WRA[10 g/L（b1）、20 g/L（b2）、30 g/L（b3）]，TiO2[10 g/L（c1）、20 g/L（c2）、30 g/L（c3）]，SiO2[10 g/L（d1）、20 g/L（d2）、30 g/L（d3）]，殼 聚糖CHS[10 g/L（e1）、20 g/L（e2）、30 g/L（e3）]，采用1.2.1 雙層包埋法中的B3組（0.3 g/L SA 溶液滴入0.2 g/L CaCl2溶液中絡(luò)合10 min）進(jìn)行人工種子膠囊的制作，以B3組人工種子膠囊作為空白（CK），參考1.2.2 的方法測定其物理特性。

1.2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對人工種子的萌發(fā)誘導(dǎo)

采用1.2.3 中b2組（20 g/L WRA）的雙層包埋法對子葉胚進(jìn)行包埋。人工種子膠囊中添加B5培養(yǎng)基、30 g/L 蔗糖和不同植物生長調(diào)節(jié)劑（MF1：1.0 mg/L 6?BA+0.1 mg/L NAA；MF2：2.0 mg/L 6?BA+0.1 mg/L NAA；MF3：0.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA；MF4：1.0 mg/L 6?BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3），制備的人工種子接種至無植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)誘導(dǎo)。每組20 粒人工種子，重復(fù)實驗 3 次。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度20 μmol/(m2·s)，16 h/18 h（晝/夜），(25±2)℃。培養(yǎng)4 周后，統(tǒng)計人工種子的萌發(fā)率。

1.2.5 低溫貯藏時間對人工種子萌發(fā)的影響

采用1.2.4 中方法對子葉胚進(jìn)行包埋，人工種子膠囊中添加B5培養(yǎng)基、30 g/L 蔗糖、1.0 mg/L 6?BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3制作人工種子，置于240 mL 組培瓶中，蓋上蓋子，貯藏在4 ℃冰箱中0、7、14、21、28 d 后，分別接種至無植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)誘導(dǎo)。每組20 粒人工種子，重復(fù)實驗3 次。

1.3 分析方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析，使用Turkey 檢驗進(jìn)行顯著性分析，對人工種子膠囊的物理性質(zhì)進(jìn)行KMO 檢驗，并對KMO值0.6 以上的物理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制作方法對人工種子膠囊物理性質(zhì)的影響

3 種制作方法獲得的人工種子膠囊質(zhì)地和形狀差異較大，顏色均呈透明、乳白色（圖1）。單層包埋法和雙層包埋法人工種子膠囊飽滿，輪廓規(guī)整，均為圓球形，偶伴有短尾?？招闹榘穹ㄖ蠧1和D1呈蝌蚪形、圓錐形，C2、C3、D2和D3均呈半帽形狀，其中，D2和D3粘結(jié)現(xiàn)象嚴(yán)重。

圖1 3 種不同制作方法制作的人工種子膠囊Fig.1 Artificial seed capsule prepration with 3 different methods

12 組人工種子膠囊的物理性質(zhì)差異顯著（P0.05）（圖2）?？招闹榉―3組初始質(zhì)量和直徑最高，顯著高于單層包埋法和雙層包埋法（P0.05）。12 組人工種子膠囊硬度隨著SA 濃度的升高而升高，其中，以雙層包埋法中的B3組最大；人工種子膠囊長徑以C1組最大，與D1組差異不顯著，但顯著高于其他組（P0.05），這表明C1和D1組長尾明顯。單層包埋法24 h 失水率較高，其中以A1組最高，顯著高于雙層包埋法和空心珠法（P0.05），其24 h 復(fù)水指數(shù)相應(yīng)地較低，相反，空心珠法中的D1～D3組人工種子膠囊失水率低，且復(fù)水指數(shù)較高，具有良好的保水和復(fù)水性能。綜合評價可得，雙層包埋法B3組最佳。

2.2 附加物對人工種子膠囊物理性質(zhì)的影響

5 種附加物的人工種子膠囊在形狀上差異較小，均呈圓球形和橢圓形，偶伴有短尾，而顏色差異較大，這與添加的附加物種類有關(guān)（圖3）。它們的物理性質(zhì)差異顯著（(P0.05，圖4），人工種子膠囊初始質(zhì)量和長徑在添加SiO2和TiO2中較低，添加保水劑b2和b3組中較高；其硬度隨附加物濃度的增加大體呈增加的趨勢，均高于CK，其中以30 g/L CHS（e3組）最高；它們24 h失水率無差異，而24 h 復(fù)水指數(shù)和直徑差異顯著，均在添加30 g/L WRA（b3組）中最高。綜合評價和整體分析可得，添加20 g/L WAR（b3組）人工種子膠囊的物理性質(zhì)最優(yōu)。

圖3 雙層包埋法添加不同附加物的人工種子膠囊Fig.3 Artificial seed capsules with different additions by double-layer embedding method

圖4 16 組人工種子膠囊的物理性質(zhì)Fig.4 Physical properties of 16 artificial seed capsules

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對人工種子的萌發(fā)效果

花櫚木人工種子培養(yǎng)1 周后，子葉胚（圖5a）突破人工種皮，陸續(xù)萌發(fā)（圖5b），但生長緩慢，很難發(fā)育形成完整的再生植株，而包埋合子胚的人工種子能夠形成健壯的再生植株（圖5c）。

圖5 花櫚木人工種子的萌發(fā)效果Fig.5 Germination of artificial seeds in O.henryi

人工種子萌發(fā)率在4 組培養(yǎng)基中無差異（圖6），均高于60%，其中以MF4組培養(yǎng)基（1.0 mg/L 6?BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3）最 高（96%），分別比第MF1、MF2、MF3組高35%、17%、33%。

圖6 植物生長調(diào)節(jié)劑對人工種子萌發(fā)的影響Fig.6 Effects of plant growth regulator on artificial seed germination

2.4 低溫貯藏時間對花櫚木人工種子萌發(fā)的影響

人工種子在4 ℃貯藏期間，無明顯褐化現(xiàn)象。貯藏第7 天和第14 天，均觀察到1 粒人工種子突破人工種皮。不經(jīng)低溫貯藏的人工種子（0 d）萌發(fā)率較高，隨貯藏時間的增加，其萌發(fā)率逐漸下降（表1），貯藏第21 天后其萌發(fā)率為0。

表1 低溫貯藏時間對人工種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of low temperature storage time on artificial seed germination

3 結(jié)論與討論

目前，人工種子的制作方法有干燥法[13]、密封端法[9]、水合法[14]和空心珠法[8]。水合法方便快捷、所用材料少、體積小、成本低、利于管理和運(yùn)輸?shù)萚15]，被廣泛運(yùn)用到人工種子的研究中。本研究發(fā)現(xiàn)水合法中雙層包埋法制作的人工種子膠囊物理性質(zhì)優(yōu)于單層包埋法，這與谷睿智[7]研究結(jié)果一致?？招闹榉ㄔ诜乐谷斯しN子水分散失和提高復(fù)水指數(shù)效果較好，但其形狀不規(guī)則，粘連現(xiàn)象嚴(yán)重，因此，繼續(xù)完善空心珠法的研究，其應(yīng)用前景廣闊。

人工種子膠囊類似于天然種子的子葉或胚乳，其除了為人工胚胎生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑外[16]，可根據(jù)需求添加滲透劑、保水劑、活性炭和抗菌劑等，為人工種子低溫儲藏提供保護(hù)[15]、減緩水分散失[7]、防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)外滲[17]和降低微生物感染[18?19]。本研究得出人工種子膠囊中添加不同附加物對其物理性質(zhì)具有較大的影響，其中以添加20 g/L 保水劑效果最優(yōu)，這與保水劑能夠降低人工種子膠囊失水率和提高人工種子膠囊復(fù)水指數(shù)有關(guān)。人工種子膠囊添加活性炭經(jīng)失水后復(fù)水，其復(fù)水指數(shù)仍較低，甚至不能復(fù)水，張銘等[20]也發(fā)現(xiàn)人工種子干燥到一定程度后是不能吸水回脹的。所以，保水劑為未來人工種子在干旱環(huán)境中的使用提供一種可能。

通常情況下，高比例細(xì)胞分裂素/生長素促進(jìn)人工種子和芽的萌發(fā)[16,21?23]。本研究發(fā)現(xiàn)，GA3可提高花櫚木人工種子萌發(fā)率，這可能與GA3對體細(xì)胞胚的萌發(fā)具有促進(jìn)作用有關(guān)[24]。花櫚木人工種子萌發(fā)率隨貯藏時間延長逐漸下降，這可能與人工種胚的質(zhì)量低，人工種子膠囊含水量高、不透氣以及長時間低溫貯藏等諸多因素共同影響有關(guān)。因此，人工種子的推廣運(yùn)用還需開展大量的試驗研究。

人工種子膠囊的物理性質(zhì)受制作方法和附加物的影響，在人工種子制作方法中，雙層包埋法較單層包埋法和空心珠法是制作人工種子膠囊較好的方法。雙層包埋法在人工種子膠囊中添加20 g/L 保水劑的人工種子膠囊物理性質(zhì)最好；花櫚木人工種子膠囊中添加B5 培養(yǎng)基、1.0 mg/L 6?BA、0.1 mg/LNAA、1.0 mg/L GA3、30 g/L 蔗糖，其萌發(fā)率最高為96%，其含水量高、不透氣和長時間低溫貯藏可能是造成其萌發(fā)率低的原因。