UPLC-HRMS結(jié)合質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)高通量分析人血漿中的代謝物

熊 倩，楊麗娟，丁筱雪，李文婷，易倫朝，張 宏,3

(1.昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500；2.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，云南 昆明 650032；3.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

代謝組學(xué)旨從生物系統(tǒng)中盡可能多地收集代謝信息，可直接反映生物事件，具有重復(fù)性好、效率高等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域強(qiáng)有力的工具。代謝組學(xué)具有靶向和非靶向性。靶向代謝組學(xué)針對(duì)已知代謝物，定量精度高，易于實(shí)現(xiàn)；非靶向代謝組學(xué)旨從樣本中檢測(cè)盡可能多的代謝物，覆蓋面更廣[1,3-4]。目前，核磁共振、質(zhì)譜等分析技術(shù)均成功應(yīng)用于代謝組學(xué)研究，其中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用最廣泛[5]。

超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)具有高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)，適用于檢測(cè)未知化合物[6]，能夠精確測(cè)量化合物的相對(duì)分子質(zhì)量，從而預(yù)測(cè)元素組成。通過二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)或多級(jí)質(zhì)譜(MSn)得到豐富的碎片離子，可在缺少化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下推測(cè)代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)[7]。但由于高分辨質(zhì)譜獲得數(shù)據(jù)的高復(fù)雜性，目標(biāo)代謝物易受到其他代謝物或基質(zhì)的干擾，甚至在某些情況下，干擾離子的強(qiáng)度遠(yuǎn)高于目標(biāo)離子，從而難以從原始數(shù)據(jù)中快速鑒定目標(biāo)代謝物，增加了代謝物定性分析的難度[8]。因此，快速、高效、準(zhǔn)確地定性代謝物仍是代謝組學(xué)研究中一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作。

質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)(MSMN)利用 MS/MS碎片的相似性組織串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過計(jì)算由質(zhì)荷比(m/z)和產(chǎn)物離子強(qiáng)度生成的向量余弦值確定MS/MS結(jié)構(gòu)相似性[9]。具有相似結(jié)構(gòu)基團(tuán)的代謝物會(huì)產(chǎn)生相似的MS/MS數(shù)據(jù)，MSMN將這些代謝物聚集在一起，將種子化合物輸入完全未知的分子網(wǎng)絡(luò)時(shí)，種子化合物生成的節(jié)點(diǎn)可以合并成類似的簇，以記錄這些類似物的結(jié)構(gòu)特征[10-11]。MSMN采用結(jié)構(gòu)化的方式組織和分析非靶向串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)信息可視化，使代謝物的結(jié)構(gòu)更易識(shí)別，加快了鑒定未知代謝物的進(jìn)程，增強(qiáng)了定性未知代謝物的覆蓋面和可信度，有利于代謝組學(xué)研究[9,12-13]。該技術(shù)應(yīng)用潛力巨大[14]，已用于植物提取物[15]、微生物[16]、尿液[17]、血漿[18]中代謝物的定性分析。

Folch方法出現(xiàn)于1957年[19]，利用氯仿-甲醇-水溶液(8∶4∶3，V/V/V)的混合溶劑提取脂類代謝物，被譽(yù)為脂質(zhì)提取方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”[20]。本研究擬利用Folch方法提取血漿，得到水相和有機(jī)相中的代謝物信息，運(yùn)用UPLC-HRMS技術(shù)檢測(cè)代謝物，以標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確定性的代謝物為種子化合物，采用MSMN篩選挖掘與種子化合物質(zhì)譜特征相似的代謝物，并將該方法用于人血漿中多類代謝物的定性分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Q-Exactive Focus軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；超聲波清洗機(jī)：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；電子分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；超純水機(jī)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；鼓風(fēng)干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇：質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；氯仿、甲酸銨：分析級(jí)，上海阿拉丁公司產(chǎn)品；內(nèi)標(biāo)溶液12-[[(環(huán)己基氨基)羰基]氨基]-十二烷酸(CUDA)：美國(guó)Cayman公司產(chǎn)品；29種標(biāo)準(zhǔn)品信息列于附表1(請(qǐng)登錄《質(zhì)譜學(xué)報(bào)》網(wǎng)站www.jcmss.com.cn下載，以下同)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1血漿樣本的采集 人血漿樣本采自云南省第一人民醫(yī)院，志愿者在空腹8 h后，于清晨從肘靜脈采血，經(jīng)肝素鋰抗凝，4 ℃靜置3 h后，以3 000 r/min離心20 min，取上清液，于-80 ℃凍存。本研究已通過云南省第一人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了所有參與者的知情同意。

1.2.2血漿樣本的前處理 取出-80 ℃冰箱中的血漿樣本，在4 ℃緩慢溶解，渦旋1 min。準(zhǔn)確吸取20 μL血漿，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(CUDA，2.0 mg/L)、320 μL冰甲醇，渦旋10 s；加入640 μL冰氯仿，渦旋10 s；再加入240 μL過膜水，渦旋20 s；靜置10 min后，以14 000 r/min離心5 min；收集有機(jī)相(下層)，用氯仿-甲醇-水溶液(8∶4∶3，V/V/V)提取水相；合并2次收集的有機(jī)相和水相，氮?dú)獯蹈珊蠓謩e復(fù)溶(有機(jī)相采用300 μL氯仿-甲醇溶液(2∶1，V/V)；水相采用200 μL甲醇)；然后分別將兩相溶液過膜后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中，待分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 有機(jī)相分析條件：ACE3 C18色譜柱(150 mm×3.0 mm×3.0 μm)；流動(dòng)相：A為異丙醇-乙腈(90∶10，V/V)和5 mmol/L甲酸銨，B為乙腈-水(60∶40，V/V)和5 mmol/L甲酸銨；自動(dòng)進(jìn)樣盤溫度4 ℃；柱溫50 ℃；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；梯度洗脫程序：0～3 min(30%A)，3～5 min(30%～50%A)，5～12 min(50%～82%A)，12～28 min(82%～99%A)，28～28.01 min(99%～30%A)，28.01～30 min(30%A)。

水相分析條件：ACE3 C18色譜柱(150 mm×3.0 mm×3.0 μm)，流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；自動(dòng)進(jìn)樣盤溫度4 ℃；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；梯度洗脫程序：2～9 min(5%～38%A)，9～14 min(38%～68%A)，14～22 min(68%～100%A)，22～32 min(100%～5%A)。

1.3.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓4.0 kV(+)、3.5 kV(-)；全掃描質(zhì)量范圍m/z100～1 200；分段掃描質(zhì)量范圍m/z100～300、299～600、599～760、759～860、859～1 200；鞘氣流速45 L/min(+)、40 L/min(-)；輔助氣流速15 L/min(+)、20 L/min(-)；傳輸毛細(xì)管溫度350 ℃(+)、320 ℃(-)；全掃描(full scan)分辨率70 000；數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描(dd MS2)分辨率35 000；隔離窗口設(shè)置：m/z1；最大注射時(shí)間100 ms(MS)、50 ms(MS/MS)；自動(dòng)增益控制(AGC)：106(MS)、105(MS/MS)；高能碰撞誘導(dǎo)電壓15、35、65 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理流程

代謝物的定性分析方法：參考文獻(xiàn)[21-25]對(duì)代謝物進(jìn)行分級(jí)定性。第1級(jí)：與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜(MS)、二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)對(duì)比定性；第2級(jí)：結(jié)合參考文獻(xiàn)，與HMDB、Massbank、Lipidmaps數(shù)據(jù)庫提供的MS、MS/MS對(duì)比定性；第3級(jí)：僅基于一級(jí)質(zhì)譜特征定性；第4級(jí)：未能鑒別的同分異構(gòu)體。

MSMN篩選代謝物及定性分析流程：1) 采用MZ mine-2.38[26]軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰的構(gòu)建、平滑、解卷積、峰對(duì)齊等處理；2) 通過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換軟件MS convert將MZ mine-2.38處理后的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為.mzXML格式；3) 使用RStudio1.0.44運(yùn)行自編R語言腳本文件，對(duì)提取的包含二級(jí)質(zhì)譜信息的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜相似度計(jì)算；4) 使用Cytoscape軟件構(gòu)建MSMN圖；5) 匹配HMDB、Massbank、Lipidmaps數(shù)據(jù)庫、查閱文獻(xiàn)，利用診斷碎片離子分析MSMN圖，實(shí)現(xiàn)對(duì)其中代謝物的分類鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)相的定性結(jié)果

采用Folch方法提取血漿中的代謝物，定性檢測(cè)到有機(jī)相中107個(gè)脂類代謝物，其中第1級(jí)14個(gè)，第2級(jí)91個(gè)，第4級(jí)2個(gè)，有64個(gè)代謝物輔以MSMN定性得到，其結(jié)果列于附表2。

2.1.1結(jié)合MSMN鑒定PC類代謝物 以PC(16∶0/18∶2)為例解釋PC的裂解規(guī)律，示于圖1。在正離子模式下，其頭部基團(tuán)磷酸膽堿斷裂產(chǎn)生m/z184.073 3碎片離子，可作為該類代謝物的診斷離子碎片。另外，還會(huì)產(chǎn)生MS/MS碎片離子m/z104.107 0、124.999 8、86.096 4[27-28]，可輔助用于PC的鑒定分析。

注：PC(16∶0/18∶2)圖1 正(a)、負(fù)(b)離子模式下，PC可能的裂解途徑及血漿樣本中PC的MS/MS圖(c)Fig.1 Possible fragmentation pathways of PC in positive (a) and negative (b) ion modes,and MS/MS spectra of PC in plasma sample (c)

正離子模式下，PC、SM的質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)圖示于圖2。分析MSMN的關(guān)鍵在于尋找種子化合物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品定性出LPC(16∶0)(溶血磷脂酰膽堿(16∶0))，其在圖2中對(duì)應(yīng)ID 43，因此暫將該簇認(rèn)定為PC類代謝物。以ID 43的相鄰節(jié)點(diǎn)ID 165為例，闡述PC類代謝物的定性過程。由于R基側(cè)鏈的不同，導(dǎo)致PC性質(zhì)不同，已知ID 43為L(zhǎng)PC(16∶0)，分子式為C24H50NO7P，準(zhǔn)分子離子為m/z496.339 8，與ID 165的準(zhǔn)分子離子m/z522.355 4相差26.015 6 u，推測(cè)為1個(gè)C2H2，則ID 165的分子式為C26H52NO7P，可推算其?；溕蟁基的碳鏈為C17H34，計(jì)算不飽和度U=(2×17+2-34)/2=1，因此推測(cè)其為L(zhǎng)PC(18∶1)。同時(shí)，其二級(jí)質(zhì)譜含有m/z184.073 2、124.999 8、104.107 3、86.096 9等碎片離子，符合PC類代謝物的裂解規(guī)律，并與Massbank數(shù)據(jù)庫收錄信息一致，因此確定ID 165為L(zhǎng)PC(18∶1)。其次，由于PC類代謝物的區(qū)域異構(gòu)體Sn-1先于Sn-2洗脫出來，Sn-1的峰強(qiáng)度小于Sn-2[28]，從而識(shí)別了LPC(0∶0/18∶1)和LPC(18∶1/0∶0)，其譜圖示于圖3。根據(jù)以上特征，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究與參考文獻(xiàn)[29]，共定性出43個(gè)PC類代謝物。

圖2 正離子模式下，SM-PC的MS/MS(a)和MSMN(b)圖，以及MSMN中被掩蓋部分的放大圖(c)Fig.2 MS/MS spectra (a) and MSMN (b) of SM-PC,and enlarged drawing of MSMN covered part (c) in positive ion mode

圖3 正離子模式下，LPC(18∶1)的提取離子流圖(a)和質(zhì)譜圖(b)Fig.3 Extracted ion chromatogram (a) and mass spectra (b) of LPC (18∶1) in positive ion mode

2.1.2結(jié)合MSMN鑒定SM類代謝物 SM的裂解規(guī)律示于圖4，與PC具有相似的結(jié)構(gòu)特征，其頭部基團(tuán)相同(均為磷酸膽堿)，其余部分脂質(zhì)的裂解規(guī)律示于附圖1。在正離子模式下，PC和SM均產(chǎn)生m/z184.073 3、124.999 8、104.107 0碎片離子，因此在MSMN圖中聚成一簇。除此之外，SM還會(huì)產(chǎn)生m/z166.062 7特征碎片，但因其響應(yīng)強(qiáng)度太低，在質(zhì)譜中難以獲得[28,30-31]，這給PC、SM的鑒定帶來了一定困難。在負(fù)離子模式下，PC和SM表現(xiàn)出不同的裂解規(guī)律，PC主要產(chǎn)生m/z168.042 0、224.068 2碎片離子，SM也產(chǎn)生m/z168.042 0碎片離子，但其強(qiáng)度顯著高于PC[30]，示于圖5，據(jù)此可將PC與SM區(qū)分開。與PC類代謝物的定性流程類似，結(jié)合SM的裂解規(guī)律，將一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息與HMDB、Lipidmaps等數(shù)據(jù)庫匹配，共定性出14個(gè)SM類代謝物。

圖4 正(a)，負(fù)(b)離子模式下，SM可能的裂解途徑Fig.4 Possible fragmentation pathways of SM in positive (a) and negative (b) ion modes

注：括號(hào)內(nèi)2.47、34.34分別代表特征碎片離子m/z 168.042 3的相對(duì)強(qiáng)度圖5 負(fù)離子模式下，LPC(16∶0)與SM(d32∶1)的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.5 MS/MS spectra of LPC (16∶0) and SM (d32∶1) in negative ion mode

此外，在負(fù)離子模式下鑒定PC、磷脂酰乙醇胺(PE)時(shí)，PE(36∶2)中出現(xiàn)了m/z224.069 3碎片離子，列于附表2，因此不能僅憑該碎片離子就認(rèn)定某代謝物屬于PC類；另外，還需注意排除代謝物的假陽性，如在圖2中，ID231為L(zhǎng)PC(16∶0)的Na加合物，但根據(jù)前體離子m/z518.321 3易將其錯(cuò)判為L(zhǎng)PC(18∶3)。

2.2 水相的定性結(jié)果

水相中共定性出80個(gè)代謝物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確定性出13個(gè)代謝物；參考數(shù)據(jù)庫或文獻(xiàn)[32-33]定性出56個(gè)代謝物，其中10個(gè)代謝物輔以MSMN定性得到；僅基于一級(jí)質(zhì)譜特征定性出11個(gè)代謝物，其結(jié)果列于附表3。分析結(jié)果表明，MSMN方法不適用于水相中代謝物的篩選。

代謝組學(xué)研究常采用甲醇沉淀蛋白法[34]提取血漿中的代謝物，該方法所獲得的部分代謝物，如氨基酸及其衍生物、脂肪酸類、糖類等代謝物在Folch方法的水相中也可檢測(cè)到。相比之下，F(xiàn)olch方法操作簡(jiǎn)單、覆蓋面廣泛，可檢測(cè)到種類、數(shù)量更多的代謝物。

2.3 MSMN不適用于部分脂類代謝物及水相提取代謝物的原因

對(duì)于PE、磷脂酸(PA)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)等代謝物，大多可在負(fù)離子模式檢測(cè)到，且特征碎片離子數(shù)量少、不同類間的差異性不顯著、同類間的質(zhì)譜相似性不強(qiáng)，難以在分子網(wǎng)絡(luò)中聚集成簇。甘油三酯(TG)雖然在分子網(wǎng)絡(luò)中聚集良好，但其結(jié)構(gòu)特征受R支鏈變化的影響，共有碎片均為m/z81.070 4等小分子離子，代表性不強(qiáng)。因此難以實(shí)現(xiàn)分類定性，不適于用質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)輔助定性。

對(duì)于水相中的代謝物，雖然在MSMN中聚集度很好，但檢測(cè)到的均為小分子代謝物，結(jié)構(gòu)特征不顯著，MS/MS碎片特征性不強(qiáng)，難以實(shí)現(xiàn)代謝物的分類鑒定。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-HRMS技術(shù)檢測(cè)人血漿中的代謝物，結(jié)合MSMN方法分析鑒定高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，共定性出187個(gè)代謝物。在有機(jī)相中，利用MSMN篩選定性出64個(gè)代謝物，其中只基于1個(gè)起點(diǎn)代謝物，定性出57個(gè)PC和SM。MSMN可縮短鑒定代謝物的時(shí)間，擴(kuò)大未知代謝物定性的覆蓋面，為代謝物的快速、準(zhǔn)確定性提供了有效的方法。此外，在血漿代謝物的提取分析中，可共同分析由Folch方法提取到的水相和有機(jī)相，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)現(xiàn)了血漿中多類代謝物的同時(shí)分析鑒定。