UPLC-MS/MS法分析柴胡郁金香顆粒中9個(gè)藥效成分在抑郁癥大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

姜春鳳，薛光輝，付麗娟，張金秋，高 穎，高 陸,

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130102)

柴胡郁金香顆粒(CHYJX)為經(jīng)典名方柴胡疏肝散的演變方，由柴胡、甘草、香附、郁金有效提取物和牡蠣超微粉組成，具有疏肝解郁、鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁等作用。中醫(yī)學(xué)理論表明[1]，抑郁癥的病因主要是“情志不舒和氣機(jī)郁滯”，肝主疏泄，是調(diào)節(jié)抑郁癥的主要臟器。柴胡是肝經(jīng)引經(jīng)藥，其抗抑郁作用受到各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。有研究表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d以及甘草次酸、甘草苷、異甘草素、甘草素、芒柄花素、甘草酸具有顯著的抗抑郁及肝臟保護(hù)作用[3-12]。藥物的藥理效應(yīng)與藥效成分在體內(nèi)的含量變化和分布特征密切相關(guān)[13]。藥代動(dòng)力學(xué)反映藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，指導(dǎo)藥物臨床應(yīng)用，在疾病治療中發(fā)揮著重要作用。因此，闡明藥物中主要藥效成分在疾病模型體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征非常必要。目前，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法在分析復(fù)雜的中藥成分及其體內(nèi)代謝物研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是藥代動(dòng)力學(xué)分析的有力手段[14-15]。

本研究擬采用UPLC-MS/MS法定性、定量分析慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠口服CHYJX后血漿中藥效成分在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)變化，闡明其藥代動(dòng)力學(xué)特征，旨為CHYJX的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Thermo Vanquish超高效液相色譜儀、TSQ Quantis三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源ESI及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))、ST8R型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；MS205DU型十萬(wàn)分之一天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；JJ1000型電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠產(chǎn)品；SB1200DT超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；BT25S型電子天平：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博睿儀器制造有限公司產(chǎn)品；MTN-2800D型氮吹儀：天津Auto-science儀器公司產(chǎn)品。

1.2 試劑與樣品

CHYJX(20191008)：吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司產(chǎn)品；甘草素(20052404，99.86%)、異甘草素(20112401，99.04%)、甘草酸(20070203，98.27%)、芒柄花素(20121601，99.40%)、柴胡皂苷c(20081202，99.90%)對(duì)照品：成都格利普生物科技有限公司產(chǎn)品；甘草次酸(110723-201715，99.6%)、甘草苷(111610-201908，95.0%)、柴胡皂苷a(110777-201912，94.8%)、柴胡皂苷d(110778-201912，96.3%)對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；甲醇和乙腈(色譜級(jí))、甲酸(質(zhì)譜級(jí))：美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品。

雄性Wistar大鼠(體質(zhì)量(200±20) g)：長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 Thermo Hypersi 1 GOLD Aq C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.9 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min(90%A)，3～10 min(90%～65%A)，10～30 min(65%～35%A)，30～56 min(35%～0%A)，56～58 min(0%A)，58～58.1 min(0%～90%A)，58.1～60 min(90%A)；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；噴霧電壓3.5 kV；霧化氣溫度20 ℃；鞘氣壓力34.48 kPa；輔助氣流速0.6 L/h；離子傳輸管溫度275 ℃；采用Xcalibur分析軟件處理數(shù)據(jù)。優(yōu)化的質(zhì)譜條件列于表1。

表1 化合物和內(nèi)標(biāo)物的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of compounds and internal standard

1.4 生物樣品收集

1.4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 選擇12只雄性Wistar大鼠，置于標(biāo)準(zhǔn)SPF(specific pathogen free)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后，對(duì)大鼠進(jìn)行一系列慢性不可預(yù)知的溫和刺激，包括夾尾2 min、45 ℃水中強(qiáng)迫游泳5 min、10 ℃水中強(qiáng)迫游泳5 min、間歇性噪聲(85 dB)刺激1 h、禁食24 h、禁水24 h、置于弄臟的籠子中24 h、置于45°傾斜的籠子中24 h、晝夜顛倒。每只大鼠每天隨機(jī)接受2種刺激，持續(xù)35天后評(píng)價(jià)大鼠對(duì)蔗糖的偏好度和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間，蔗糖偏好度低下且強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)的大鼠為抑郁癥成模大鼠。

1.4.2血漿樣品收集 選擇6只造模成功的抑郁癥大鼠，禁食禁水12 h后，灌胃給予CHYJX混懸液，依據(jù)人體臨床常用劑量按體表面積法折算成大鼠劑量(0.45 g/kg)，分別于給藥后0.083、0.17、0.25、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12和24 h經(jīng)眼眶靜脈叢取500 μL血于1.5 mL肝素化EP管中，在4 ℃下以3 500 r/min離心15 min，吸取上層血漿于EP管中，-80 ℃冰箱保存。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液及QC的制備 分別精密稱取適量的柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、甘草次酸、甘草苷、異甘草素、甘草素、芒柄花素、甘草酸對(duì)照品，用甲醇配制成單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取適量的各對(duì)照品溶液，以乙腈為稀釋液，配制系列混合對(duì)照品溶液，于4 ℃冰箱保存。

1.5.2內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取11.08 mg地高辛對(duì)照品(相當(dāng)于10.88 mg地高辛)，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到1.09 g/L地高辛儲(chǔ)備液。以乙腈為稀釋液，配制21.76 μg/L內(nèi)標(biāo)溶液。

1.5.3血漿樣品處理 量取200 μL 1.4.2節(jié)收集的血漿樣品于EP管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和600 μL乙腈，渦旋振蕩2 min，在4 ℃下以13 000 r/min離心20 min，取上清液，用30 ℃氮?dú)獯蹈?。向殘?jiān)屑尤?00 μL乙腈-水溶液(1∶1，V/V)，渦旋振蕩2 min，以13 000 r/min離心15 min，吸取5 μL上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.5.4方法學(xué)考察 選擇性考察：分別量取200 μL 6只大鼠空白血漿、加入10 μL被測(cè)物的大鼠空白血漿、給藥1 h后的大鼠血漿，按照1.5.3節(jié)方法處理，評(píng)價(jià)方法的選擇性。

殘留考察：檢測(cè)3次被測(cè)物的定量上限(ULOQ)樣品，即表2中線性范圍最高點(diǎn)濃度樣品，再檢測(cè)空白樣品，評(píng)價(jià)方法的樣品殘留。

線性考察：分別精密吸取10 μL系列濃度的對(duì)照品溶液，加入200 μL空白血漿，按照1.5.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣，記錄峰面積，以被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)(y)，相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，加權(quán)最小二乘法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

準(zhǔn)確度考察：取大鼠的空白血漿配制被測(cè)物高、中、低和定量下限(LLOQ)4個(gè)濃度的質(zhì)量控制(QC)樣品，共制備3批，每批每個(gè)濃度配制6份平行樣品，按1.5.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度和方法的準(zhǔn)確度與精密度。

提取回收率：配制6份含9個(gè)被測(cè)物的高、中、低和LLOQ 4個(gè)濃度的血漿樣品，按照1.5.3節(jié)方法處理后進(jìn)樣分析；另取經(jīng)乙腈-水溶液(1∶1，V/V)配制相同濃度的被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)樣品溶液進(jìn)樣分析。將2種處理方法得到的被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值進(jìn)行比較，計(jì)算方法的提取回收率。

基質(zhì)效應(yīng)考察：各量取200 μL 6只抑郁癥大鼠的空白血漿，按1.5.3節(jié)方法處理，不加入內(nèi)標(biāo)溶液，氮?dú)獯蹈珊?，向殘?jiān)屑尤?00 μL經(jīng)乙腈-水溶液(1∶1，V/V)配制的被測(cè)物對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)樣分析；另取經(jīng)乙腈-水溶液(1∶1，V/V)配制相同濃度的被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)樣品溶液進(jìn)樣分析。記錄2種方法得到的被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，計(jì)算被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)因子，以及內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子，評(píng)價(jià)方法的基質(zhì)效應(yīng)。

穩(wěn)定性考察：取200 μL大鼠的空白血漿，加入混合對(duì)照品溶液，制備被測(cè)物高、低2個(gè)濃度的QC樣品，每個(gè)濃度平行6份，按照1.5.3節(jié)方法處理，在室溫下于1天內(nèi)的不同時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定，評(píng)估24 h內(nèi)的穩(wěn)定性；將QC樣品于-20 ℃保存15天后測(cè)定，評(píng)估15天內(nèi)的穩(wěn)定性；反復(fù)凍融3次后進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)反復(fù)凍融穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1選擇性 選擇性用以判定目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)與基質(zhì)中內(nèi)源性組分或樣品中其他組分區(qū)分的程度，6只大鼠的空白血漿、空白血漿加入被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物、以及給藥1 h后血漿樣品中被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的檢測(cè)結(jié)果示于圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物在保留時(shí)間內(nèi)沒(méi)有干擾，峰形良好，表明該方法具有良好的專屬性。

2.1.2殘留考察 重復(fù)進(jìn)樣3次ULOQ樣品后，再進(jìn)樣空白樣品，在空白樣品中未提取到被測(cè)物的色譜峰，表明不存在被測(cè)物殘留。

2.1.3線性和LLOQ 大鼠血漿中9種被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r2)列于表2。可見(jiàn)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.992 5～0.998 1，均大于0.99，線性方程可用于計(jì)算樣品中被測(cè)物含量。

表2 線性關(guān)系考察Table 2 Investigation of linear relationship

2.1.4精密度與準(zhǔn)確度 大鼠血漿中9種被測(cè)物的精密度與準(zhǔn)確度列于表3。高、中、低和LLOQ濃度QC樣品的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度在88.38%～110.94%之間，在QC樣品標(biāo)示值的±15%之內(nèi)；精密度(RSD)在3.75%～10.74%之間，小于15%。表明本方法的精密度與準(zhǔn)確度良好。

表3 本方法的精密度與準(zhǔn)確度(n=6)Table 3 Precision and accuracy of this method (n=6)

續(xù)表3

2.1.5提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 血漿中9種被測(cè)物的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)列于表4。提取回收率在88.74%～109.76%之間，RSD小于15%；基質(zhì)效應(yīng)在89.63%～108.34%之間，變異系數(shù)小于15%。表明本方法的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)良好。

注：a 空白血漿；b 空白血漿添加被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物；c 給藥1 h的大鼠血漿圖1 血漿樣品的UPLC-MS/MS 色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of plasma samples

表4 方法的提取回收率(n=6)Table 4 Extraction recovery rate of the method (n=6)

續(xù)表4

2.1.6穩(wěn)定性 穩(wěn)定性能夠反映環(huán)境改變對(duì)樣品的影響，將血漿樣品在室溫存放24 h，-20 ℃存放15天以及3次反復(fù)凍融，樣品中9種被測(cè)物的檢測(cè)準(zhǔn)確度和精密度列于表5。準(zhǔn)確度在90.56%～107.15%之間，在QC樣品標(biāo)示值的±15%之內(nèi)；精密度(RSD)在3.23%～8.20%之間，小于15%。表明樣品的穩(wěn)定性良好。

表5 化合物在大鼠血漿中的穩(wěn)定性(n=6)Table 5 Stability of the compounds in rat plasma (n=6)

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究

利用本方法檢測(cè)抑郁癥大鼠血漿中9種被測(cè)物在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的含量，繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線，并通過(guò)DAS 3.1.6軟件計(jì)算CHYJX的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果分別示于圖2，列于表6。CHYJX中9個(gè)藥效成分的Tmax為0.27～4.06 h，t1/2為3.51～7.76 h，平均駐留時(shí)間MRT(0-t)為7.13～11.48 h，MRT(0-∞)為6.61～21.46 h。藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)為70.06～1 280.4 μg·h/L，AUC(0-∞)為79.86～1 407.83 μg·h/L。其中，甘草酸的AUC(0-t)最大，tmax最小，表明甘草酸在血漿中的藥物暴露量最大，并且能夠在胃腸道被快速吸收，甘草酸可通過(guò)炎癥機(jī)制發(fā)揮抗抑郁作用[16]，是CHYJX中的重要成分。除甘草次酸外，其他8種成分的tmax均小于0.51 h，表明CHYJX能夠在胃腸道被快速吸收。甘草酸在腸道菌群的作用下可轉(zhuǎn)化成甘草次酸[17]，本研究中甘草次酸表現(xiàn)出較晚的Tmax和較長(zhǎng)的t1/2，可能與腸道菌群代謝有關(guān)，是CHYJX中的長(zhǎng)效成分。9個(gè)成分的t1/2為3.51～7.76 h，表明單次CHYJX給藥后，其在體內(nèi)能夠被盡快消除，不易產(chǎn)生殘留和蓄積，藥物安全性好。通過(guò)藥時(shí)曲線結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、異甘草素、甘草素、甘草酸這6個(gè)成分均具有第2個(gè)吸收峰，表明它們?cè)隗w內(nèi)可能發(fā)生了肝腸循環(huán)、不同化合物轉(zhuǎn)化、多部位吸收或腸道外排現(xiàn)象。

表6 抑郁癥大鼠口服CHYJX后9個(gè)藥效成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(x±SD，n=6)Table 6 Pharmacokinetic parameters of 9 pharmacodynamic components after oral administration of CHYJX in depressed rats (x±SD,n=6)

圖2 抑郁癥大鼠口服CHYJX后9個(gè)藥效成分的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Average blood concentration-time curves of 9 pharmacodynamic components after oral administration of CHYJX in depressed rats n=6)

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)建立了同時(shí)定量分析大鼠血漿中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、甘草次酸、甘草苷、異甘草素、甘草素、芒柄花素、甘草酸等9個(gè)成分的方法，該方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，考察的選擇性、殘留、線性、精密度與準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等結(jié)果均符合生物樣品定量的分析要求。采用本方法對(duì)抑郁癥大鼠灌胃CHYJX后血漿中9個(gè)成分的含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的增加，9個(gè)成分的含量在抑郁癥大鼠體內(nèi)呈規(guī)律性變化。研究表明，CHYJX在胃腸道能夠被快速吸收，體內(nèi)消除速度較快，不易產(chǎn)生殘留和蓄積，藥物安全性好。本研究不僅為血漿中這9個(gè)成分的同時(shí)定量提供參考方法，也為CHYJX的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供理論支撐。